趙歡歡，周宏勝，劉夢竹，羅淑芬，李鵬霞,3*

1(南京農業(yè)大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)2(江蘇省農業(yè)科學院 農產品加工所，江蘇 南京，210014)3(江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京，210014)

黃金梨富含多糖、礦物質、維生素等多種人體所需的營養(yǎng)物質，并以其細膩多汁的口感深受消費者喜愛。在黃金梨大量上市銷售期間經常暴露于常溫環(huán)境中，而常溫貯藏期間黃金梨極易發(fā)生果心褐變[1]，并會逐漸蔓延至果肉，降低其口感和商品價值，嚴重阻礙了黃金梨產業(yè)的發(fā)展。因此，研究梨果實的防褐變技術很有必要。

目前，一些研究人員對黃金梨貯藏期間防褐變方法進行了研究，趙猛等[2]研究了1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)與乙烯吸收劑對黃金梨的防褐效果的影響，得出0.5和1.0 μL/L的1-MCP處理均對黃金梨果心褐變具有抑制作用，乙烯吸收劑的作用可減少1-MCP對果實的傷害。石磊等[3]的研究表明，當黃金梨貯藏環(huán)境中O2和CO2濃度較高時，果心褐變比較嚴重，并且褐變的發(fā)生時間也較早。在較低CO2(1%)和O2(5%)條件下可以將黃金梨的貯藏期延長至180 d。郭艷明[4]研究了微波處理及抗氧化涂膜對黃金梨褐變的調控作用，得出緩慢降溫條件下，對果實進行微波處理可以防止褐變。但是，目前對于黃金梨采后防褐變技術仍然較少。

己醛(hexanal)是一種已探明的植物內源性芳香物質，在李子[5]、黃瓜[6]、獼猴桃[7]、葡萄[8]等果蔬中均有檢出。己醛已被MOHD等[9]的研究團隊證明是一種有效的磷脂酶D(phospholipase D, PLD)受體抑制劑，能夠顯著降低PLD的轉錄表達，進而在膜脂代謝途徑中抑制番茄的衰老。LANCIOTTI等[10]則認為己醛是通過顯著抑制霉菌、酵母菌、嗜溫和嗜冷菌的生長水平，從而抑制蘋果片氣調貯藏過程中的褐變進程。然而，己醛處理對黃金梨常溫貯藏品質及膜脂代謝的影響目前尚未見報道。

本文采用5 μL/L己醛處理黃金梨果實，對黃金梨亮度、褐變指數(shù)、硬度、可溶性固形物、呼吸速率等品質指標進行分析，同時關注膜脂代謝的運行變化，旨在探討己醛處理對黃金梨采后果心褐變的影響，為其應用推廣奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用黃金梨采自江蘇省南京市溧水基地，采摘成熟度均勻、無病蟲害的果實，套果實網套后用紙箱包裝運抵實驗室進行處理。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

醋酸、CaCl2、蔗糖、MgCl2、KNO3,西隴化工股份有限公司;1,3-磷脂酰膽堿、雷氏銨、三氟化硼-甲醇、KOH、甘油、芐基磺酰氯,上海麥克林生化科技有限公司;CHCl3、HClO4、KCl,國藥集團化學試劑有限公司;交鏈聚乙烯吡咯烷酮(crosslinked polyvinylpyrrolidone, PVPP)、亞油酸鈉，源葉生物；甲醇、H2SO4、乙醚,南京化學試劑股份有限公司;Tris、疊氮化鈉、釩酸鈉,北京索萊寶科技有限公司;β-巰基乙醇,北京盛科博源生物科技有限公司;醋酸鈉,廣東光華科技股份有限公司;二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT),翊圣生物;石油醚,北京長海化工廠;HCl,宏景化工;正己烷,廣東省化學試劑工程技術研究開發(fā)中心;鉬酸銨,安徽精鉬化學試劑有限公司;FeSO4,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;MgSO4,上海統(tǒng)亞化工科技發(fā)展有限公司;NaCl,上海久億化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純；油酸、亞油酸、亞麻酸、軟脂酸、棕櫚酸、甲醇、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)均為色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；脂肪酶活力測定試劑盒,南京建成生物工程研究所。

1.2.2 主要儀器

PAL-1型數(shù)顯手持折光儀, 日本 Atago 公司；FT-011手持硬度計，意大利 Affri 公司；TU-1810 紫外-可見分光光度計，北京譜析通用儀器；PL202-L型多功能酸度計、PL202-L型分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；3K15 高速冷凍離心機，Sigma公司；A11 Basic型液氮研磨器，廣州艾卡儀器設備有限公司CR-400全自動色彩色差計，日本柯尼卡美能達公司。

1.3 實驗方法

為篩選適宜的己醛處理濃度，采用2.5、5、10和20 μL/L的乙醛對黃金梨進行熏蒸，以無任何處理為空白對照(CK)，密閉熏蒸8 h后，解除密封進行2 h通風處理。將黃金梨隨機裝入21 L的帶孔保鮮箱中，每處理設置3個重復。置于(20±1) ℃、85%～90%相對濕度條件下貯藏。20 d后，觀察不同濃度己醛處理對黃金梨果心褐變的影響，由此篩選出合適的處理濃度。

研究適合濃度的己醛處理對常溫貯藏期間黃金梨品質及膜脂代謝的影響，貯藏條件同上，貯藏期間每5 d取樣1次，進行指標的測定。其中呼吸速率和乙烯釋放量采用鮮樣測定，其他指標測定所需樣品均用液氮速凍后貯藏在-80 ℃冰箱中。

1.4 品質指標的測定方法

1.4.1 果實亮度及褐變指數(shù)的測定

亮度參考劉紅艷等[11]的方法，利用全自動色差計測定黃金梨果實亮度，取果實最大橫徑處對向2個點，切去果皮進行測定，測30次取平均值，亮度用L*表示。褐變率按公式(1)計算：

(1)

果心褐變指數(shù)測定參考閆師杰[12]的方法，貯藏期間每5 d取15個果實，將果實沿著果心中心部位橫切，觀察果心橫切面的褐變級別。褐變級別分為5個等級，無褐變?yōu)?級；輕微褐變?yōu)?級；輕微褐變至褐變部位占全部面積20%以下為2級；20%～50%為3級；褐變部位大于50%為4級。按照公式(2)計算褐變指數(shù)：

(2)

1.4.2 呼吸速率和乙烯釋放量的測定

呼吸速率的測定參考高建曉等[13]的方法，略有改動。貯藏期間每5 d取15個果實，稱重后平均置于3個4.5 L具孔樂扣保鮮盒中，用橡膠塞塞緊，在(20±1) ℃環(huán)境下密封悶氣4 h后，用20 mL注射器抽取樣氣10 mL用于氣相色譜儀的測定。樣氣經安捷倫7820型氣相色譜儀測定，色譜條件：FID檢測器，柱溫80 ℃，外標法定量，每個處理重復3次。

乙烯釋放量的測定參考NISHIKAWA[14]等的方法，略有改動。制備樣氣方法同呼吸速率的測定，色譜條件：FID檢測器，柱溫70 ℃。

1.4.3 硬度、可溶性固形物(total soluble solids,TSS)的測定

在果實最大橫徑處對角位置切去2個1 cm2果皮，用手持硬度計垂直勻速插入果肉中，讀取硬度計上的數(shù)值，每個處理測定15個果實。

TSS的測定方法參考黎春紅等[15]的方法，采用手持折光儀進行測定。

1.4.4 PLD活性的測定

參考SUTTLE等[16]的方法，略有修改。取2 g黃金梨果心樣品，用8 mL 0.1 mol/L pH 5.6的醋酸緩沖液(含10 g/L)浸提，于4 ℃下為，10 000 r/min離心15 min(10 000 r/min)，取上清液即為待測粗酶液。

反應底液的制備：取40 mg 1,3-磷脂酰膽堿溶于50 mL乙醚，N2吹干后溶于0.1 mol/L pH 5.6的醋酸緩沖液中(含5 mmol/L DTT，1 mol/L CaCl2)，即得0.4 mg/mL的反應底液。

反應體系包含1 mL酶液和3 mL反應底液，置于520 nm下測定吸光值A1，將原體系置于28 ℃搖床上于黑暗條件反應1 h后，加入石油醚萃取3次，取水相，加入2 mL 10 g/L雷氏銨，10 000 r/min離心10 min,取沉淀溶解于5 mL丙酮中，測定反應體系在520 nm下的吸光值A2。以520 nm下每小時吸光值變化0.001為1個酶活力單位，用U/mg表示。

1.4.5 脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)活力的測定

LOX活力測定方法參考AXELROD等[17]的方法，略作改動。粗酶液的制備：2 g凍樣加入8 mL磷酸緩沖液(pH 7.8，含0.05 mol/L巰基乙醇)，充分混勻后浸提2 h，4 ℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清液待測。反應體系總量為3 mL，包含2.9 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.0)，50 μL 10 mmol/L亞油酸鈉，50 μL稀釋3倍后的粗酶液。以2.95 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0)，50 μL 10 mmol/L亞油酸鈉體系為空白。在30 ℃下保溫反應，234 nm處進行掃描，以吸光值每分鐘上升0.01為1個酶活力單位，用U/mg表示。每個處理重復3次。

1.4.6 脂肪酶(lipase,LPS)活力的測定

脂肪酶活力采用南京建成公司生產的脂肪酶活力測定試劑盒進行測定。前期制備200 g/L上清液，浸提液為0.2 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液(含0.05 mol/L巰基乙醇)。

1.4.7 脂肪酸組成及不飽和指數(shù)的測定

參考LIN等[18]的方法，略有改動。5 g凍樣加入10 mL抽提液，搖勻后加入10 mL 0.1 mol/L HCl，4 000×g離心10 min，收集有機相后置于N2氣氛中吹干，蒸干物質與1 mL三氟化硼-甲醇共同沸騰10 min，用正己烷提取沸騰后的液體，重復3次后氮氣吹干，蒸干物重新溶于200 μL氯仿，過0.22 μm濾膜后等待上機測定。抽提液為V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(0.1 mol/L HCl)=200∶100∶1混合液。

脂肪酸不飽和度用不飽和指數(shù)來表示。參考羅淑芬等[19]的方法，不飽和指數(shù)(index of unsaturated fattyacid,IUFA)按公式(3)計算:

IUFA=1×油酸含量(%)+2×亞油酸含量(%)+3×亞麻酸含量(%)

(3)

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本研究所有數(shù)據(jù)處理均用Excel完成，結果以平均值±標準差表示，圖表采用Origin 9.0軟件繪制，顯著性采用SAS軟件進行分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 己醛濃度篩選

從圖1可以看出，5 μL/L己醛熏蒸的黃金梨在貨架第20天時果心的褐變程度最小，其他處理都出現(xiàn)了不同程度的果心褐變。因此，選擇5 μL/L己醛對黃金梨進行處理。

圖1 不同濃度的己醛熏蒸對黃金梨感官品質的影響Fig.1 Effects of different concentrations of hexanal fumigation on sensory quality of Whangkeumbae pears

2.2 己醛處理對常溫貯藏黃金梨果實品質的影響

2.2.1 己醛處理對常溫貯藏黃金梨果實亮度及褐變率的影響

黃金梨貯藏過程中，果肉亮度和果心褐變指數(shù)是衡量保鮮貯藏品質優(yōu)劣的重要指標之一，也是判斷其貯藏壽命的直觀依據(jù)。由圖2-a可知，貯藏期間，CK和己醛處理的黃金梨果肉亮度均呈現(xiàn)波動下降的趨勢，且CK組下降幅度較己醛處理組。貯藏10 d后，己醛處理組果肉的亮度顯著高于CK組(P<0.05)。由此可見，己醛處理能夠有效延緩貯藏后期梨果肉亮度的降低。

圖2 己醛處理對黃金梨果實亮度及褐變指數(shù)的影響Fig.2 Effects of hexanal treatment on L* and browning index of Whangkeumbae pears注：*表示同一時間不同處理間差異顯著(P<0.05)(下同)

圖2-b顯示，在整個常溫貯藏期間，果心褐變呈逐漸上升趨勢，且 CK組的黃金梨果心褐變指數(shù)均顯著高于己醛處理組(P<0.05)，說明己醛處理能夠顯著抑制黃金梨果心褐變指數(shù)升高。

2.2.2 己醛處理對常溫貯藏黃金梨呼吸速率和乙烯釋放量的影響

黃金梨屬呼吸躍變型果實，其呼吸速率直觀地反映了果實的生理狀態(tài)。由圖3-a可知，黃金梨在整個常溫貯藏期間呼吸速率總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在第15天達到呼吸高峰。整個貯藏期間，除第20天外，己醛處理組黃金梨的呼吸速率皆顯著低于CK組(P<0.05)，可見己醛處理明顯抑制了黃金梨的呼吸速率。由圖3-b可見，與呼吸速率相同，在整個貯藏期間，CK和己醛處理的黃金梨乙烯釋放量的變化趨勢為先升高后下降，在第15天到達高峰。在貯藏10、15、25 d時，CK組黃金梨乙烯釋放量顯著高于己醛處理組(P<0.05)，說明己醛處理在一定程度上可有效抑制黃金梨采后乙烯的釋放。

圖3 己醛處理對黃金梨呼吸速率和乙烯釋放量的影響Fig.3 Effects of hexanal treatment on respiration rate and ethylene release of Whangkeumbae pears

2.2.3 己醛處理對常溫貯藏黃金梨硬度和TSS含量的影響

硬度和可溶性固形物是表征黃金梨果實品質的重要指標，TSS含量反映了果實營養(yǎng)物質的積累和消耗情況。由圖4-a可知，在整個常溫貯藏期內，黃金梨果實硬度呈現(xiàn)下降趨勢，尤其貯藏中期即第10、20天，硬度下降較快，經己醛處理組硬度下降較CK組緩慢，但與CK組僅在第15天時呈顯著差異(P<0.05)。在整個貯藏期間，己醛處理組和CK組果實的TSS含量總體均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖4-b)。CK組黃金梨在貯藏15 d時達到TSS積累峰值，己醛處理組推遲了TSS積累高峰的到來。在貯藏至15 d后，CK組TSS含量迅速下降，而己醛處理整體下降緩慢，且在20～25 d期間顯著高于CK組(P<0.05)，可見己醛處理可延緩黃金梨貯藏后期可溶性固形物的下降，但對其硬度影響不大。

圖4 己醛處理對黃金梨硬度及可溶性固形物含量的影響Fig.4 Effects of hexanal treatment on firmness and TSS of Whangkeumbae pears

2.3 己醛處理對常溫貯藏黃金梨PLD活力的影響

PLD能夠水解磷脂，釋放磷脂酸，是維持細胞膜流動性的關鍵酶。如圖5所示，黃金梨在常溫貯藏期間PLD活力整體呈波動變化的趨勢。在整個貯藏期內，己醛處理組PLD活力始終顯著低于CK組(P<0.05)。尤其在15 d時CK組黃金梨果心PLD活力達到峰值，為3.04 U/g，是同時期己醛處理黃金梨的1.9倍。這說明己醛處理對黃金梨PLD具有很好的抑制效果。

圖5 己醛處理對黃金梨磷脂酶活力的影響Fig.5 Effects of hexanal treatment on PLD activity of Whangkeumbae pears

2.4 己醛處理對常溫貯藏黃金梨LOX活力的影響

LOX是參與果實膜脂代謝的關鍵酶。由圖6可知，在黃金梨常溫貯藏期間，果心LOX活力總體呈現(xiàn)先上升后小幅下降的趨勢，且CK與己醛處理組具有相同的變化趨勢。在整個貯藏期內，己醛處理組LOX活力在10～20 d期間顯著低于CK組(P<0.05)，這表明己醛處理整體上能夠有效抑制常溫貯藏中期黃金梨果心LOX活力。

圖6 己醛處理對黃金梨脂氧合酶活力的影響Fig.6 Effects of hexanal treatment on LOX activity of Whangkeumbae pears

2.5 己醛處理對常溫貯藏黃金梨LPS活力的影響

LPS可將脂肪水解成甘油和脂肪酸，從而影響黃金梨膜脂代謝過程。從圖7可知，在常溫貯藏期間黃金梨果心LPS活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。貯藏5 d后，CK組的黃金梨LPS活力顯著高于己醛處理組(P<0.05)，尤其在15 d時CK組果心LPS活力是己醛處理組的1.21倍。上述結果表明，己醛處理能夠在常溫貯藏期間抑制脂肪酶活力地上升。

圖7 己醛處理對黃金梨脂肪酶活力的影響Fig.7 Effects of hexanal treatment on LPS activity of Whangkeumbae pears

2.6 己醛處理對常溫貯藏黃金梨脂肪酸組成的影響

脂肪酸是組成生物細胞膜的重要成分，其組成會影響細胞膜的穩(wěn)定性。黃金梨果心脂肪酸主要由棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)以及亞麻酸(C18∶3)等組成。從圖8可知，未經處理的黃金梨果心棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸以及亞麻酸的含量分別為1.290 0、0.577 5、17.856 3、6.590 0以及5.337 5 μg/g?？梢娪退崾屈S金梨果心膜脂肪酸的主要成分，其含量的高低直接影響了黃金梨常溫貯藏品質。

由圖8-a可知，在常溫貯藏期間，CK黃金梨果心棕櫚酸含量在貯藏15 d時達到峰值，隨后緩慢下降；而己醛處理組呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。在貯藏5 d后己醛處理組棕櫚酸含量顯著低于CK組(P<0.05)。由圖8-b可以看出，黃金梨果心硬脂酸含量整體呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。在整個貯藏期，CK組黃金梨果心硬脂酸含量顯著高于己醛處理(P<0.05)。圖8-c表明，黃金梨果心油酸含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在第10天時達到峰值，且在貯藏10 d后CK組顯著低于己醛處理組。由圖8-d可知，對照組亞油酸的含量在貯藏前期(0～15 d)呈現(xiàn)下降趨勢，貯藏后期(15～25 d)含量有所上升，己醛處理組亞油酸含量總體變化不大。在貯藏中后期(10～25 d)，己醛處理組亞油酸含量均顯著高于CK組(P<0.05)。由圖8-e可知，亞麻酸含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢，在整個貯藏期己醛處理組亞麻酸含量均高于CK組，但僅在第10天時具有顯著性差異(P<0.05)。以上結果說明，己醛處理可有效延緩油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸的氧化和棕櫚酸、硬脂酸等飽和脂肪酸含量積累。

2.7 己醛處理對常溫貯藏黃金梨IUFA和脂肪酸比值的影響

由圖9-a可知，隨著貯藏時間的延長，黃金梨果心的IUFA水平呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，說明不飽和脂肪酸在貯藏過程中被不斷氧化，這也是造成果心褐變的一個重要原因。在整個貯藏期，己醛處理組IUFA值始終顯著高于CK組(P<0.05)。由圖9-b可知，黃金梨果心膜脂不飽和脂肪酸∶飽和脂肪酸(unsaturated∶saturated,U∶S)同樣呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。己醛熏蒸處理組U∶S值顯著高于CK組(P<0.05)，這說明己醛可有效抑制黃金梨果實不飽和脂肪酸氧化。

圖9 己醛處理對黃金梨脂肪酸IUFA與U∶S的影響Fig.9 Effects of hexanal treatment on IUFA and the ratio of unsaturated fatty acid to saturated fatty acid (U∶S) of Whangkeumbae pears

3 結論與討論

黃金梨貯藏過程中，隨著貯藏時間的延長，其品質會有所下降。具體表現(xiàn)在果實顏色變暗、呼吸速率加快、乙烯釋放量升高、果粒軟化、可溶性固形物含量升高、果心褐變等，其中最嚴重的問題就是黃金梨果心的褐變。韓雅萱[20]發(fā)現(xiàn)1-MCP處理可顯著抑制果心、果肉褐變的發(fā)病率、病情指數(shù)、乙烯釋放速率、呼吸強度等指標，由此延緩梨果心的褐變。李少華[21]開發(fā)了一種殼聚糖-抗褐變劑-植物精油的復合型涂膜保鮮液，將其涂抹到檸檬鮮切片上，可有效減緩其酚酸、過氧化物酶和多酚氧化酶等指標變化，由此抑制檸檬切片酶促褐變的發(fā)生。在本實驗中發(fā)現(xiàn)己醛處理可有效降低黃金梨采后呼吸速率、乙烯釋放量，果肉TSS的消耗，以及維持果肉和果心的色澤，由此抑制果心褐變。朱萍[22]的研究發(fā)現(xiàn)乙醛熏蒸能顯著延緩鮮切菠蘿在貯藏過程中的褐變和軟化現(xiàn)象。

采后梨貯藏過程中細胞膜發(fā)生氧化，膜脂過氧化逐漸加劇，由此造成細胞膜系統(tǒng)遭受破壞，導致細胞內酚類物質泄露，與空氣中的氧氣接觸，發(fā)生酶促褐變，導致果心褐變，因此防止細胞膜脂過氧化是延緩其采后褐變的關鍵。在膜脂過氧化過程中，主要體現(xiàn)為不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，而在這個過程中，PLD、LPS等酶發(fā)揮了關鍵作用，這些酶活性的增強會加劇膜脂過氧化速度。本實驗發(fā)現(xiàn)己醛處理有可有效抑制PLD、LPS、LOX等酶的活性，由此抑制脂肪酸的氧化，延緩膜脂過氧化進程，己醛處理組提高了IUFA和U∶S也證實了這一推論。LIN等[23]也發(fā)現(xiàn)，沒食子酸丙酯抑制了龍眼的PLD、LPS、LOX等酶活性，并抑制脂肪酸的氧化，由此抑制了膜脂過氧化，從而延緩了其果實的采后褐變。此外，研究發(fā)現(xiàn)己醛是黃金梨PLD酶較好的抑制劑，這與JINCY等[24]和 PADMANABHAN等[25]對芒果和甜櫻桃的研究結果類似。

綜上所述，己醛處理能夠通過維持較低的呼吸速率和乙烯釋放量，減少TSS的消耗，保持良好的果肉色澤來保證黃金梨果實貯藏品質，并能通過抑制膜脂代謝途徑中關鍵酶，尤其是PLD的活性，來抑制不飽和脂肪酸的氧化，由此保護細胞膜系統(tǒng)不遭受破壞，從而抑制黃金梨果心產生褐變。