朱 博 陳 攀 王 輝 丁 科

目前冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病是影響人類健康的主要疾病之一，而高脂血癥又是誘導(dǎo)疾病的重要因素，中醫(yī)藥治療高脂血癥得到普遍認(rèn)可并具有廣泛的前景[1]。Toll 樣受體4（TLR4）的激活與脂多糖（LPS）密切相關(guān)，并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF-6）是TLR4 下游信號(hào)分子中重要一環(huán)，在敲除TRAF-6 基因的小鼠中，TLR4 介導(dǎo)的炎癥因子及趨化因子明顯減少[2-3]。本研究采用金黃地鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立飲食性高脂血癥模型，觀察給藥后造模地鼠血脂生化指標(biāo)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法分別檢測(cè)炎癥因子血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量和肝臟組織膽固醇7α 羥化酶（CYP7A1）含量；采用Western blot 檢測(cè)和qRT-PCR 檢測(cè)觀察理氣化痰祛瘀方對(duì)金黃地鼠肝臟組織TTLR4 和TRAF-6 的表達(dá)，探討其在TLR4/TRAF-6 信號(hào)通路中所起的可能機(jī)制和作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 雄性LVG 敘利亞金黃地鼠60只，7 周齡，體質(zhì)量（120±10）g，由北京維通利華公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11400700240693。于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心按屏蔽環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 藥品及主要試劑 理氣化痰祛瘀方（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備提供，批號(hào)201708-201711）；非諾貝特（上海衡山藥業(yè)有限公司，批號(hào)23267）；生理鹽水（河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)A17021309）；膽固醇（鑫汐生物，批號(hào)D12451）；起酥油（車輪牌，批號(hào)Q/ZPN0002S）；蛋黃粉（康德蛋業(yè)，批號(hào)D12450B）；3 號(hào)膽鹽（源業(yè)生物有限公司，批號(hào)S31332-100g）；基礎(chǔ)飼料（浙江省醫(yī)科院，批號(hào)D110700）；TC、TG 試劑盒（雅培制藥有限公司，批號(hào)4818UN16，1206UN16）；LDL-c、HDL-c 試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)92649095，92650099）；IL-6、TNF-α、CYP7A1 ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號(hào)均為201710）；RIPA 裂解液（碧云天，批號(hào)P0013D）；PMSF（Sigma，批號(hào)ST505）；蛋白酶抑制劑（碧云天，批號(hào)P1005）；BCA 蛋白定量試劑盒（Solarbio，批號(hào)pc0020）；HRP標(biāo)記的二抗（華安生物，批號(hào)HA1001-100）；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑（Affinity，批號(hào)K001/K002）；預(yù)染蛋白marker（Solarbio，批號(hào)PR1910）；TLR4（Proteintech，批號(hào)19811-1-AP）；TRAF-6（Affinity，批號(hào)AF5376）；β-Actin（華安，批號(hào)M1210-2）；TRIzon 總RNA 提取試劑（康為世紀(jì)，批號(hào)CW0580）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，批號(hào)639503）；SYBR Green qPCR 試劑盒（Takara，批號(hào)RR430S）；無水乙醇（滬試，批號(hào)64-17-5）；氯仿（滬試，批號(hào)67-66-3）；異丙醇（滬試，批號(hào)67-63-0）。

1.3 主要儀器 C16000 型全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（美國雅培公司）；NIKON ECLIPSE TI-SR 倒置熒光顯微鏡（日本尼康）；生化培養(yǎng)箱（上海齊欣）；Micro17R 低溫高速離心機(jī)（Thermo）；CMaxPius 酶標(biāo)儀（Spectia-Max）；VE 180C 電泳儀電泳槽（天能）；VE186 轉(zhuǎn)膜儀（天能）；Mastercycler Pro 型PCR 儀（德國EPPENDORF）；5804R 型冷凍離心機(jī)（德國EPPENDORF）；CFX-96 touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad）；紫外分光光度計(jì)（蘇州島津公司）；自動(dòng)勻漿器（IKA 公司）。

1.4 動(dòng)物分組及處理 60 只健康成年雄性LVG 敘利亞金黃地鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，測(cè)定各項(xiàng)血脂指標(biāo)篩選接近正常血脂水平的金黃地鼠，根據(jù)數(shù)字表隨機(jī)分配法挑選8 只作為正常組，其余作為造模組，分別喂予普通飼料和高脂飼料（82.5%普通飼料、10%起酥油、2%膽固醇、0.5%3 號(hào)膽鹽、5%蛋黃粉）。造模2 周后，禁食12h 采用尾靜脈取血測(cè)定TC 含量，篩選TC＞6.76mmol/L 40 只作為高脂血癥模型地鼠。

將成模地鼠根據(jù)數(shù)字表隨機(jī)分配法分為五組，即模型組、理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組（6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1）、非諾貝特組（150mg·kg-1·d-1），每組8 只，各組地鼠分別灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，正常組和模型組分別灌服等容量生理鹽水，每天1 次。6 周后解剖金黃地鼠，取肝臟稱重0.2g，加入10 倍磷酸緩沖鹽溶液（PBS），部分制備肝臟勻漿上清液，其余部分置放在-80℃液氮保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 金黃地鼠血清TC、TG、LDL-c 和HDL-c 生化指標(biāo)檢測(cè) 分別于高脂飼料飼喂第0、2、8 周，空腹禁食12h（不禁水），眼眶采血0.5mL，靜置30min 后，3000 r/min 離心10min，制備血清備用。采用生化分析儀檢測(cè)金黃地鼠血清TC、TG、LDL-c 和HDL-c 的含量。

2.2 ELISA 檢測(cè)高脂血癥金黃地鼠血清IL-6、TNFα 含量，肝臟組織CYP7A1 含量 給藥后第6 周（飼喂第8 周），空腹禁食12h（不禁水），眼眶采血0.5mL，靜置30min 后，3000r/min 離心10min，制備血清備用；解剖金黃地鼠，取肝臟稱重0.2g，加入10 倍PBS 勻漿，制備肝臟勻漿上清液，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。

2.3 Western blot 檢測(cè)金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達(dá) 肝臟組織加入RIPA 裂解液（含PMSF 和蛋白酶抑制劑） 勻漿，冰上裂解30min，12000rpm 離心5min，取上清。采用二喹啉甲酸（BCA） 法檢測(cè)肝臟組織總蛋白濃度，用酶標(biāo)儀A562nm 波長測(cè)定；加入緩沖溶液在沸水浴中變性，5%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，分離膠經(jīng)甲醇和轉(zhuǎn)膜液浸濕的聚偏氟乙（PVDF）膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜；用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5～2h，將膜放入一抗稀釋液平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜，用TBST 洗膜10min×3 次；加入含辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗稀釋液，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2h；用TBST 洗膜10min×3 次。暗室X 線曝光，以β 肌動(dòng)蛋白（β-Actin）抗體作為內(nèi)參對(duì)照，通過比較目標(biāo)蛋白的灰度值進(jìn)行半定量分析。

2.4 qRT-PCR 檢測(cè)金黃地鼠肝臟組織TLR4、TRAF-6 mRNA 水平 將液氮-80℃速凍保存的樣品用康為世紀(jì)公司的Trizol 試劑盒進(jìn)行總RNA 的提取，具體方法參照說明書。采用分光光度法檢測(cè)提取RNA的OD 值并計(jì)算濃度，保證RNA 抽提純度和完整性。用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將所得RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在Realtime PCR 儀上進(jìn)行PCR 實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)，記錄并分析其mRNA 表達(dá)量差異。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)所用引物的序列由上海生工生物工程有限公司提供，TLR4 上游其序列為5'-CTCAGAGAGAGCCAGTGGAA-3'，下游引物序列為5'-GGAGCATTAGTGAACCCTCG-3'；TRAF-6 上游引物序列為5'-CAACTTGTCAGCCCTCCTTT-3'，下游引物序列為5'-TGGAAGAATAGCCAGTGCTCT-3'，GAPDH 上游引物序列為5'-AACAGGGTGGTGGACCTCAT-3'，下游引物序列為5'-TGCTCTCAGTATCCTTGCTG-3'。qPCR 反應(yīng)擴(kuò)增體系為20μL：2×EvaGreen 擴(kuò)增混合物（美國Bio-Rad 公司）10μL，前引物1μL，后引物1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。擴(kuò)增條件：94℃1min；95℃10s 高溫變性、58℃10s、72℃10s 退火/延伸，40 個(gè)循環(huán)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的LSD 法（最小顯著性法），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠血脂水平的影響 高脂飼喂第8 周（理氣化痰祛瘀方給藥第6 周），與正常組比較，模型組金黃地鼠TC、TG、LDL-c 含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，理氣化痰祛瘀方中、高劑量組和非諾貝特組TC、TG、LDL-c 含量顯著下降（P＜0.05），HDL-c 含量無顯著性差異（P＞0.05）。其中，非諾貝特組TC、TG、LDL-c含量下降程度最高，理氣化痰祛瘀方給藥后TC、TG、LDL-c 含量下降程度高低依次為理氣化痰祛瘀方中、高、低劑量組[4]。見表1。

3.2 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠炎癥因子的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05），肝臟組織CYP7A1含量顯著下降（P＜0.05）。非諾貝特和理氣化痰祛瘀方給藥6 周，與模型組比較，非諾貝特組、理氣化痰祛瘀方中、高劑量組金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 含量顯著下調(diào)，肝臟CYP7A1 含量則顯著上升（P＜0.05）。理氣化痰祛瘀方給藥6 周后金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 含量下降程度高低依次為理氣化痰祛瘀方高、中、低劑量組。見表2。

3.3 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達(dá)水平的影響 與正常組比較，模型組金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，非諾貝特組金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組金黃地鼠肝臟組織TLR4 蛋白表達(dá)水平和TRAF-6 蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。見表3，圖1。

3.4 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 mRNA 表達(dá)水平的影響 與正常組比較，模型組金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，非諾貝特組金黃地鼠肝臟組織TLR4、TRAF-6 水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組金黃地鼠肝臟組織TLR4、TRAF-6 水平顯著下調(diào)（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。見表4。

4 討論

目前臨床上常用他汀類藥物作為防治心血管疾病的一線藥物，但許多患者對(duì)他汀類藥物治療具有耐藥性，最終仍死于心肌梗死或中風(fēng)[5]。與西藥相比中藥雖然治療高脂血癥機(jī)制復(fù)雜，但不良反應(yīng)較少。中醫(yī)認(rèn)為，高脂血癥主要由痰瘀痹阻、臟腑功能不足形成，強(qiáng)調(diào)肝脾失調(diào)是該病的病理基礎(chǔ)，痰瘀是其病變之標(biāo)，多采用具有祛痰化瘀、升清降濁、補(bǔ)氣活血功效的中藥進(jìn)行治療[6-7]。理氣化痰祛瘀方由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院陳芝蕓教授臨床驗(yàn)方演變而來，由桃仁、山楂、郁金、澤瀉、海藻、象貝、香櫞、萊菔子、茯苓組成，其中生山楂祛瘀消積；茯苓、澤瀉除水濕，消痰濁；桃仁破血逐瘀，與澤瀉配用，分流疏導(dǎo)，使邪有退路；郁金、香櫞疏肝利膽，行氣消痰；海藻、象貝化痰軟堅(jiān)散結(jié)，以助痰瘀的消除。諸藥合用，痰、濕、瘀、積得除，肝脾功能得調(diào)，氣血壅滯得通，該方經(jīng)過臨床辨證加減，對(duì)治療高脂血癥有明顯的療效。

表1 給藥第6 周對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠血脂水平的影響（mmol/L，）

表1 給藥第6 周對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠血脂水平的影響（mmol/L，）

注：正常組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃；非諾貝特組予非諾貝特懸液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組分別予依次劑量為6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TC 為總膽固醇；TG 為三酰甘油；LDL-c 為低密度脂蛋白膽固醇；HDL-c 為高密度脂蛋白膽固醇；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方低劑量組比較，cP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方高劑量組比較，dP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方中劑量組比較，eP＜0.05

表2 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 及肝臟組織CYP7A1 含量的影響（）

表2 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 及肝臟組織CYP7A1 含量的影響（）

注：正常組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃；非諾貝特組予非諾貝特懸液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組分別予依次劑量為6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；IL-6 為白細(xì)胞介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子α；CYP7A1 為膽固醇7α 羥化酶；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方低劑量組比較，cP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方中劑量組比較，dP＜0.05

表3 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 蛋白表達(dá)水平影響（）

注：正常組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃；非諾貝特組予非諾貝特懸液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組分別予依次劑量為6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TLR4 為Toll 樣受體4；TRAF-6 為腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6；β-Actin 為β 肌動(dòng)蛋白；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方低劑量組比較，cP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方中劑量組比較，dP＜0.05

表4 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平的影響（）

表4 理氣化痰祛瘀方對(duì)高脂血癥模型金黃地鼠肝臟組織TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平的影響（）

注：正常組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃；非諾貝特組予非諾貝特懸液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理氣化痰祛瘀方低、中、高劑量組分別予依次劑量為6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TLR4 為Toll 樣受體4；TRAF-6 為腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6；β-Actin 為β 肌動(dòng)蛋白；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方低劑量組比較，cP＜0.05；與理氣化痰祛瘀方中劑量組比較，dP＜0.05

文獻(xiàn)表明，脂肪細(xì)胞中LPS 作為TLR4 主要配體，可以激活TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，而TRAF-6 作為TLR4 信號(hào)通路中最重要的一環(huán)，在促炎及凋亡過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。我們前期研究證明，理氣化痰祛瘀方能有效降低高脂血癥模型金黃地鼠血清血脂水平，TC、TG、LDL-c 含量下降程度高低依次為理氣化瘀方中、高、低劑量組，并在一定程度上能改善高脂血癥金黃地鼠肝臟病理變化程度[10]；實(shí)驗(yàn)還證明，其在一定程度上能恢復(fù)高脂血癥金黃地鼠腸道菌群紊亂，改善菌群失衡，重新形成穩(wěn)定的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)[4]；理氣化痰祛瘀方能有效降低高脂血癥金黃地鼠血清IL-6、TNF-α 含量（P＜0.05），其肝臟組織CYP7A1 含量則顯著上升（P＜0.05），提示理氣化痰祛瘀方可以有效減少IL-6、TNF-α 等炎癥因子的分泌，改善大鼠肝組織的炎癥程度，提高機(jī)體對(duì)脂質(zhì)的消化吸收及對(duì)膽固醇的代謝作用。故筆者認(rèn)為理氣化痰祛瘀方能有效干預(yù)金黃地鼠高脂血癥發(fā)生和發(fā)展，對(duì)治療高脂血癥有著積極的意義。

TLR4 作為介導(dǎo)先天免疫和炎癥反應(yīng)的主要受體，激活后通過髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴性途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB 活化促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6 等）分泌，與肝內(nèi)脂肪堆積形成脂肪變性導(dǎo)致的肝組織受損共同形成脂肪性肝炎[11-12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂血癥模型金黃地鼠在理氣化痰祛瘀方用藥干預(yù)后顯著抑制TLR4、TRAF-6 蛋白水平及mRNA 的高表達(dá)（P＜0.05），但對(duì)下游依賴途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路其他炎性因子IL-1、TGF-B、p40 以及Toll 樣受體相關(guān)分子（TRAM）和由B 干擾素TIF 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）聯(lián)接的非依賴性通路發(fā)揮的影響作用還無法確定。因此，在攝入高脂或高能量飲食后血漿LPS 水平明顯增加后，是否可以通過抑制TLR4 信號(hào)通路及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路元件等相關(guān)促炎因子表達(dá)，在治療高脂血癥中發(fā)揮作用的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。