崔永哲

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中的一種常見(jiàn)亞型[1]。臨床治療中發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤患者常與肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)陽(yáng)性密切相關(guān)，惡性淋巴瘤合并HBV感染僅次于肝癌[2]，二者關(guān)系引起廣大研究人員注意。乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是HBV病毒發(fā)揮作用的重要物質(zhì)[3]，在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖、凋亡中具有確切作用[4,5]，但目前研究尚未解釋HBV感染在DLBCL發(fā)生發(fā)展中的作用以及機(jī)制。本研究通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式將HBx基因轉(zhuǎn)入DLBCL細(xì)胞株SUDHL-4中，研究HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并初步探討其可能機(jī)制，為DLBCL合并HBx患者治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DLBCL細(xì)胞株SUDHL-4購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；BALB/c裸鼠[4周，體重10～15 g，飼養(yǎng)溫度20～26℃，飼養(yǎng)溫度40%～70%，光照周期12 h，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041]購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；攜HBx基因重組質(zhì)粒pcDNA3.1-x為本室構(gòu)建；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Trizol提取試劑盒、Lipofectamine 3000相關(guān)試劑購(gòu)自Invitrogen公司；CCK-8實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將SUDHL-4細(xì)胞凍存管取出，放入37℃水浴鍋快速解凍，置于裝有3 ml 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中離心管，離心后棄上清，加入1 ml 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，吹打混勻吸入無(wú)菌培養(yǎng)瓶，加入4 ml培養(yǎng)基混勻，置于環(huán)境為37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，按照實(shí)驗(yàn)室方法傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SUDHL-4細(xì)胞及分組:采用Lipofec-tamin 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋pcDNA3.1質(zhì)粒、pcDNA3.1-HBx重組質(zhì)粒，并與Lipofectamin 3000按1∶1比例混合后室溫孵育10 min，靜置20 min，加入培養(yǎng)孔，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，更換為含G418(終濃度為400 μg/ml)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，每隔3 d更換培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，以含G418(終濃度為200 μg/ml)的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-HBx重組質(zhì)粒的SUDHL-4細(xì)胞為SUDHL-4-HBx組，轉(zhuǎn)入pcDNA3.1質(zhì)粒的SUDHL-4細(xì)胞為SUDHL-4-con組，設(shè)置未轉(zhuǎn)染的SUDHL-4細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.3 qRT-PCR法檢測(cè)HBx表達(dá):采用RNA抽提試劑盒提取1.2.2各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Bio Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性，用去離子水將cDNA稀釋10倍后-20℃保存。qRT-PCR程序設(shè)定為：95℃預(yù)熱3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，以上3步驟經(jīng)歷35次循環(huán)，72℃ 5 min終止反應(yīng)。HBx上游引物為5’-TCATCGCCAGCATCATCAAAC-3’，下游引物為5’-ATGTACGGCTGGAGGTCTGTCA-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為463 bp。以GAPDH為內(nèi)參基因，上游引物為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物為5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

1.2.4 免疫印跡法(western blotting，WB)法檢測(cè)蛋白表達(dá):取1.2.2中各組細(xì)胞，加入300 μl蛋白裂解buffer(含1 mmol/L PMSF)，提取總蛋白，通過(guò)BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，以GAPDH為內(nèi)參，采用WB法檢測(cè)各組組織中HBx蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照并進(jìn)行定量分析。做3次重復(fù)，取平均值。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:按照1.2.2分組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞放入離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，取10 μl細(xì)胞懸液，加入含1 ml RPMI 1640的EP管內(nèi)，吹打混勻，取10 μl稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1.0×105個(gè)/ml細(xì)胞密度接種于12孔板，每孔100 μl，每組6個(gè)復(fù)孔。在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48、72、96 h 后，每孔加入10 μl濃度為1.5 mg/ml的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，讀取吸光度值(A)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，測(cè)定時(shí)以未接種細(xì)胞只加培養(yǎng)基孔的A值為空白對(duì)照調(diào)零。

1.2.6 皮下移植瘤法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:選取四周齡雄性BALB/c裸鼠，喂養(yǎng)無(wú)菌水與食物。將約2×106個(gè)細(xì)胞(SUDHL-4)注入裸鼠右側(cè)背部，出現(xiàn)明顯腫瘤時(shí)，隨機(jī)分為3組，每組10只，裸鼠瘤內(nèi)分別注射100 μl RPMI-1640培養(yǎng)基、pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-HBx重組質(zhì)粒，30 d后處死小鼠，摘除腫瘤計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積=長(zhǎng)×寬2×1/2。

1.2.7 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力:使用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。3組細(xì)胞缺氧培養(yǎng)48 h，胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，離心棄上清液，配制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，100 μl細(xì)胞懸液加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)情況 熒光顯微下SUDHL-4-HBx組、SUDHL-4-con組中細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均>90%。與對(duì)照組比較，SUDHL-4-con組HBx mRNA、HBx蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SUDHL-4-HBx組HBx mRNA、HBx蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與SUDHL-4-con組比較，SUDHL-4-HBx組HBx mRNA、HBx蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2，表1。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞增殖影響 CCK8試驗(yàn)顯示，與空白組相比，SUDHL-4-con組各時(shí)間點(diǎn)OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SUDHL-4-HBx組轉(zhuǎn)染后48、72、96 h OD值顯著升高(P<0.05)；與SUDHL-4-con組相比，SUDHL-4-HBx組轉(zhuǎn)染后48、72、96 h OD值顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表2。

圖1 熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

HBx蛋白表達(dá)條帶圖

表1 轉(zhuǎn)染后HBx mRNA及HBx蛋白表達(dá)情況

注：與SUDHL-4組比較，*P<0.05；與SUDHL-4-con組比較，#P<0.05

表2 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞增殖影響(OD值)

2.3 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)影響 與SUDHL-4組比較，SUDHL-4-con組裸鼠腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SUDHL-4-HBx組裸鼠腫瘤體積顯著升高(P<0.05)；與SUDHL-4-con組比較，SUDHL-4-HBx組裸鼠腫瘤體積顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞凋亡影響 與SUDHL-4組比較，SUDHL-4-con組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SUDHL-4-HBx組細(xì)胞凋亡率

表3 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)影響

表3 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)影響

組別腫瘤體積SUDHL-4組 816.37±34.18SUDHL-4-con組829.71±35.29SUDHL-4-HBx組1 526.85±56.72*#

注：與SUDHL-4組比較，*P<0.05；與SUDHL-4-con組比較，#P<0.05

顯著降低(P<0.05)；與SUDHL-4-con組比較，SUDHL-4-HBx組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表4。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞凋亡影響

表4 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞凋亡影響

2.5 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與SUDHL-4組比較，SUDHL-4-con組PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase 3蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SUDHL-4-x組PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bax、Caspase 3蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與SUDHL-4-con組比較，SUDHL-4-x組PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bax、Caspase 3蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表5。

圖5 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響；A代表SUDHL-4組；B代表SUDHL-4-con組；C代表SUDHL-4-HBx組

表5 穩(wěn)定表達(dá)HBx對(duì)SUDHL-4細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響

3 討論

DLBCL是非霍奇金淋巴瘤中常見(jiàn)類(lèi)型，占所有病例1/3左右，臨床上以高侵襲性、中高度惡化為主要特點(diǎn)[6,7]。惡性淋巴瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究顯示病毒的慢性感染在淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。HBV是一種嗜肝細(xì)胞病毒，其具有較強(qiáng)親淋巴細(xì)胞特性[9]。臨床數(shù)據(jù)顯示DLBCL患者HBV感染率顯著高于健康者及其他腫瘤患者，DLBCL合并HBV發(fā)生率僅低于肝癌[9]。上述研究均表明HBV病毒感染與DLBCL的發(fā)生可能有一定相關(guān)性。而HBx是HBV病毒基因組中開(kāi)放編碼區(qū)，是HBV復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等方面發(fā)揮重要作用[10]，有研究證明，HBx可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲，抑制肝癌細(xì)胞凋亡[11-13]，但HBx在DLBCL細(xì)胞中研究較少，本研究重點(diǎn)探討HBx對(duì)人DLBCL細(xì)胞株SUDHL-4細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為DLBCL合并HBx患者治療提供理論依據(jù)。

Wang等[14]研究顯示，人DLBCL患者中HBV感染率高。本研究中152例DLBCL患者檢測(cè)出HBV感染30例，感染率為19.7%，分析發(fā)現(xiàn)，合并HBV感染與患者臨床分期、肝功能有關(guān)，提示HBV感染可能影響DLBCL的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究進(jìn)一步構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx基因的SUDHL-4細(xì)胞模型，為HBV感染和DLBCL關(guān)系研究提供基礎(chǔ)，另一方面也可以通過(guò)SUDHL-4-HBx篩選合適治療藥物。Zhu等[15]研究表明，HBx基因具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用，HBx通過(guò)滅活p53蛋白活性，抑制其調(diào)控，從而發(fā)揮促進(jìn)增殖。本研究中，轉(zhuǎn)染后48、72、96 h，SUDHL-4-HBx組細(xì)胞OD值顯著高于SUDHL-4-con組及SUDHL-4組，提示轉(zhuǎn)染HBx后SUDHL-4細(xì)胞增殖能力增加。PCNA是DNA復(fù)制過(guò)程中所必須的調(diào)節(jié)蛋白，含量高低可反映細(xì)胞增殖活躍程度，廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤及增生性疾病的增殖過(guò)程研究[16]。本研究中，SUDHL-4-HBx組增殖相關(guān)蛋白PCNA水平顯著高于SUDHL-4-con組及SUDHL-4組，提示轉(zhuǎn)染HBx后細(xì)胞增殖更活躍。荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)研究顯示，表達(dá)HBx基因的裸鼠較不表達(dá)HBx的裸鼠瘤塊生長(zhǎng)速度更快，表明在體內(nèi)HBx具有與體外相同的刺激瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的作用。細(xì)胞凋亡是維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，主動(dòng)清除體內(nèi)損傷細(xì)胞、感染細(xì)胞的過(guò)程，大量研究顯示，癌細(xì)胞不僅存在增殖速度過(guò)快，凋亡過(guò)程也受到影響[17,18]。本研究中，轉(zhuǎn)染48 h后SUDHL-4-HBx組細(xì)胞凋亡率顯著低于SUDHL-4-con組及SUDHL-4組細(xì)胞，提示HBx過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程。目前關(guān)于HBx引起的凋亡信號(hào)通路日益受到研究人員關(guān)注，但目前尚未形成統(tǒng)一定論[19]。促調(diào)亡基因Bax與抗調(diào)亡基因Bcl-2同屬Bcl家族，二者比例決定細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)[20]。本研究SUDHL-4-HBx組促凋亡相關(guān)蛋白Bax、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著高于SUDHL-4-con組與SUDHL-4組，此外執(zhí)行凋亡蛋白Caspase 3表達(dá)低于SUDHL-4-con組與SUDHL-4組，提示HBx可能通過(guò)影響凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子Bcl-2、Bax、Caspase 3等蛋白表達(dá)，抑制SUDHL-4細(xì)胞凋亡。

綜上所述，HBV感染與DLBCL患者臨床分期及肝損傷有關(guān)，過(guò)表達(dá)HBx可促進(jìn)SUDHL-4細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。