王捷 張亞楠 張瑜 高旭輝

非小細(xì)胞肺癌是全球最常見(jiàn)肺癌的重要亞型，其治療已從傳統(tǒng)的手術(shù)切除、放化療發(fā)展到免疫治療和分子靶向治療[1]；然而，有關(guān)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不完全清楚。Notch信號(hào)通路是一條進(jìn)化上高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2-4]。Notch的重要配體——Jagged1在卵巢上皮癌、腎透明細(xì)胞癌和乳腺癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中異常高表達(dá)，且在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5-7]。有研究指出，Jagged1在非小細(xì)胞肺癌組織中異常高表達(dá)，且其表達(dá)水平與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[8,9]；而靶向干擾Jagged1可抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]，但其在非小細(xì)胞肺癌中的作用尚不完全清晰。因此，本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)旨在揭示Jagged1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡中的作用，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑與儀器 肺腺癌細(xì)胞系NCI-H1975、A549和正常支氣管上皮細(xì)胞系16-HBE(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H520、SK-MES-1(中科院昆明細(xì)胞庫(kù))，硝酸纖維素膜(美國(guó)PALL公司)，RIPA裂解緩沖液和BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)，STAT3、p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2、Survivin、GAPDH 和VEGF抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、Lipofectamine TM 2000和RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，胎牛血清和青霉素鏈霉素雙抗(美國(guó)HyClon公司)，胰蛋白酶、二甲基亞砜和MTT試劑(美國(guó)Sigma公司)，山羊抗兔/鼠IgG二抗(北京中杉金橋公司)，ECL試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)，Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室和流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，倒置相差顯微鏡(日本NiKon公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海復(fù)日公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將16-HBE、NCI-H1975、A549、NCI-H520、SK-MES-1細(xì)胞系接種于含100 U/ml青霉素鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。每2天更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，并按照1∶3比例傳代。實(shí)驗(yàn)所有細(xì)胞為生長(zhǎng)狀況良好的第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3 Western blot檢測(cè) 向待檢測(cè)的細(xì)胞中加入RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白后，采用BCA法檢測(cè)總蛋白的濃度。將熱變性的蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠分離后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1.5 h后，加入特異性一抗于4℃下孵育24 h。洗膜后，加入二抗于室溫下孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光后，以凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以目的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為3組，即對(duì)照組(正常培養(yǎng))、NC-siRNA組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照)和Jagged1-siRNA組(轉(zhuǎn)染Jagged1干擾序列Jagged1-siRNA)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以5×104個(gè)接種至6孔細(xì)胞板上，將細(xì)胞按照如上進(jìn)行分組，置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)75%時(shí)，參照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)將siRNA按照實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后，換新鮮培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集3組細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞中Jagged1蛋白的表達(dá)水平以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。其中，Jagged1干擾序列Jagged1-siRNA(F:5’-GAAUGUGAGGCCAAACCUU-3’，R:5’-CCUGUAACAUAGCCCGAAA-3’)和陰性對(duì)照NC-siRNA(F:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，R:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’)由美國(guó)Invitrogen 公司合成。

1.5 MTT法檢測(cè) 在96孔細(xì)胞板上以每孔105個(gè)密度接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞按照1.4進(jìn)行分組和轉(zhuǎn)染。其中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，棄上清，每孔加入濃度為5 g/L MTT溶液 20 μl孵育4 h，再加入二甲基亞砜震蕩反應(yīng)至MTT結(jié)晶充分溶解后，采用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)3組細(xì)胞的OD值。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 在6孔細(xì)胞板上以每孔104接種轉(zhuǎn)染48 h后的各組A549細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。以10%甲醇固定細(xì)胞30 min后，滴加0.5%結(jié)晶紫染色15 min。洗去染色液并晾干后，采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的克隆形成情況。將超過(guò)15個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)有效克隆，以(克隆數(shù)/種植細(xì)胞數(shù))的百分比表示3組細(xì)胞的克隆形成率。

1.7 Transwell小室 在24孔細(xì)胞板上以每孔105個(gè)接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，按照1.4中進(jìn)行分組并轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，以無(wú)血清培養(yǎng)基制備濃度為5×103個(gè)/ml細(xì)胞懸液。在 Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室中加入細(xì)胞懸液100 μl，并在下室中加入含血清培養(yǎng)基500 μl。置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室，使用棉簽將上室中殘留的細(xì)胞輕輕擦去后，以甲醛對(duì)下層細(xì)胞固定30 min，并滴加0.5%結(jié)晶紫染色15 min。洗去染色液后，采用倒置顯微鏡統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以隨機(jī)選取的5個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)的均值表示。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔細(xì)胞板上以每孔105個(gè)細(xì)胞密度接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜后，按照1.4中進(jìn)行分組(每組3個(gè)重復(fù))并轉(zhuǎn)染。待細(xì)胞貼壁后，以移液槍槍頭垂直于背部(接種細(xì)胞前每隔0.5 cm過(guò)孔畫(huà)橫線)橫線劃痕，以磷酸緩沖液洗去不再貼壁細(xì)胞后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0 h和24 h時(shí)間點(diǎn)取樣，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移情況，其中以(0 h劃痕距離-目標(biāo)時(shí)點(diǎn)劃痕距離)/0 h劃痕距離的百分比表示細(xì)胞的遷移率，結(jié)果以隨著選取的5個(gè)視野內(nèi)的遷移率的均值表示。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 胰酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的對(duì)照組、NC-siRNA組和Jagged1-siRNA組細(xì)胞，預(yù)冷磷酸緩沖液洗滌2次后，以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/ml。向100 μl細(xì)胞懸液中依次加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μl PI，充分混勻后，避光反應(yīng)15 min。補(bǔ)加上樣緩沖液200 μl后，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行3組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Jagged1在非細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)染效果 與正常支氣管上皮16-HBE細(xì)胞(0.11±0.02)比較，Jagged1在肺腺癌NCI-H1975、A549和肺鱗癌NCI-H520、SK-MES-1細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平[(0.52±0.03)、(0.87±0.06)、(0.44±0.03)、(0.28±0.03)]均升高(P<0.05)；其中，在A549細(xì)胞中最高，在SK-MES-1細(xì)胞中最低。與對(duì)照組(0.96±0.06)比較，轉(zhuǎn)染Jagged1-siRNA后A549細(xì)胞中Jagged1蛋白的表達(dá)水平(0.23±0.02)降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染NC-siRNA對(duì)A549細(xì)胞中Jagged1蛋白的表達(dá)(0.88±0.07)無(wú)明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)Jagged1在非細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá);A為Jagged1在4種非細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá);B為轉(zhuǎn)染后Jagged1在A549細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

2.2 Jagged1-siRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染24～72 h后Jagged1-siRNA組A549細(xì)胞的OD值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)，Jagged1-siRNA組細(xì)胞的克隆形成率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；但是，NC-siRNA組和對(duì)照組細(xì)胞的OD值及克隆形成率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Jagged1-siRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.3 Jagged1-siRNA對(duì)A549細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與對(duì)照組比較，Jagged1-siRNA組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移率均明顯降低(P<0.05)；但NC-siRNA組與對(duì)照組之間侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Jagged1-siRNA對(duì)A549細(xì)胞侵襲和遷移的影響

2.4 Jagged1-siRNA對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組、NC-siRNA組和Jagged1-siRNA組細(xì)胞凋亡率分別為(5.18±1.02)%、(7.25±1.23)%和(20.36±2.45)%，3組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)，Jagged1-siRNA組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而NC-siRNA組和對(duì)照組之間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

2.5 Jagged1-siRNA對(duì)肺癌A549細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，Jagged1-siRNA組細(xì)胞中STAT3磷酸化水平及其下游相關(guān)靶基因CyclinD1、Bcl-2、Survivin、VEGF蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，而NC-siRNA組細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖3。

表3 Jagged1-siRNA對(duì)肺癌A549細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的影響

圖3 Western blot檢測(cè)STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

Jagged1是在哺乳動(dòng)物中第一個(gè)被證實(shí)的Notch受體的配體，可通過(guò)與鄰近細(xì)胞的Notch受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合活化Notch，與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合，激活靶基因，參與細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程[8]。高表達(dá)的Jagged1與膽管細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌等腫瘤浸潤(rùn)深度、有無(wú)復(fù)發(fā)和總生存時(shí)間等密切相關(guān)[11,12]。張保龍等[13]在骨髓瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Jagged1表達(dá)可抑制RPMI8226細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡[13]。Hao等[14]在膠質(zhì)瘤的研究中指出，敲除Jagged1表達(dá)可抑制U251細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Hai等[15]研究指出，Jagged1通過(guò)激活NF-κB途徑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞侵襲。此外，干擾Jagged1還可增強(qiáng)卵巢癌對(duì)順鉑化療藥的敏感性[16]。已有研究指出，Jagged1在非小細(xì)胞肺癌組織中異常高表達(dá)[8]，但其具體的調(diào)控作用研究較少。本研究在肺腺癌NCI-H1975、A549和肺鱗癌NCI-H520、SK-MES-1細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)了Jagged1高表達(dá)，同時(shí)干擾Jagged1表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在胞內(nèi)外致瘤信號(hào)的刺激下，STAT3信號(hào)通路異常激活可通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[17,18]。CyclinD1是促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的重要細(xì)胞周期蛋白，Bcl-2和Survivin是公認(rèn)的凋亡抑制蛋白，VEGF是促進(jìn)血管生長(zhǎng)最強(qiáng)的調(diào)控因子，它們的啟動(dòng)子區(qū)均有能夠與活化的STAT3高親和結(jié)合位點(diǎn)，是STAT3下游的重要靶基因[19,20]。有研究證實(shí)，Jagged1可通過(guò)調(diào)控STAT3信號(hào)通路的活化影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和卵巢癌細(xì)胞遷移[21]。為了探討Jagged1調(diào)控非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾Jagged1表達(dá)后A549細(xì)胞中STAT3磷酸化水平及其下游相關(guān)靶基因CyclinD1、Bcl-2、Survivin、VEGF蛋白的表達(dá)水平均明顯降低。結(jié)果提示，Jagged1可能通過(guò)調(diào)控STAT3信號(hào)通路影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Jagged1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制STAT3信號(hào)通路的活化有關(guān)。