李月月，王前進(jìn)，田 珊，王佳麗，趙旭升

（洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471934）

【研究意義】黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是我國蔬菜作物上的主要病毒，在全球范圍廣泛傳播［1-2］，嚴(yán)重影響作物生長和產(chǎn)量，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3-4］。洛陽地區(qū)的蔬菜種植比較廣泛，及時(shí)明確CMV在洛陽地區(qū)蔬菜作物上的發(fā)生情況，對于提前做好相關(guān)防控、防止CMV在該地區(qū)的大暴發(fā)十分重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CMV是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的代表種，為典型的三分子單鏈正義RNA（+ssRNA）病毒，基因組大小約為8.6 kb，由3個(gè)RNA片段（RNA1、RNA2、RNA3）構(gòu)成［5］。CMV是目前已知寄主范圍最多、分布范圍最廣、危害性最大的植物病毒之一，可以通過蚜蟲、種子、寄生植物以及汁液摩擦傳播［6］，能侵染 1 000多種植物［7-8］。植株被CMV侵染后不能正常生長，表現(xiàn)出斑駁、褪綠、花葉、蕨葉、畸形、皺縮、壞死等癥狀［5-6,9］。CMV在我國大陸31個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、市）的茄科、葫蘆科、豆科和十字花科作物上均有發(fā)生，其中茄科和葫蘆科作物上發(fā)生最為嚴(yán)重，其次是豆科作物，十字花科作物上相對較少。我國大部分地區(qū)的辣椒、番茄、南瓜、菜豆、豇豆、蘿卜和大白菜上均有CMV的發(fā)生，尤其在河南、天津和廣東的番茄以及河南、海南的南瓜上發(fā)生率最高［1］。近年來由于各種蔬菜作物新品種的引進(jìn)、栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大以及農(nóng)業(yè)生態(tài)氣候的變化，植物病毒病的發(fā)生越來越嚴(yán)重，而CMV的為害更加猖獗。CMV由于基因組的差異，具有豐富的遺傳多樣性，根據(jù)其寄主范圍、致病性、血清學(xué)分析、編碼外殼蛋白（Coat protein, CP）的基因序列分析等將CMV株系分為兩個(gè)不同亞組，即CMV亞組Ⅰ（CMVⅠ）和CMV亞組Ⅱ（CMVⅡ）［5-6］。目前在我國蔬菜作物上報(bào)道的CMV大部分為CMVⅠ，CMVⅡ的發(fā)生相對較少［10-16］，而CMVⅠ的危害比CMVⅡ大得多，不僅并發(fā)癥狀明顯，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株直接壞死，引起蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物大量減產(chǎn)。

【本研究切入點(diǎn)】及時(shí)監(jiān)測某一地區(qū)CMV的發(fā)生情況和鑒定并做好對CMV的防控工作極為重要，但目前我國對CMV的發(fā)生報(bào)道主要集中在范圍較大的地區(qū)如省（自治區(qū)、市），針對特定地區(qū)的報(bào)道相對較少。本研究通過田間調(diào)查和RT-PCR檢測方法在洛陽地區(qū)的蔬菜作物上開展CMV的調(diào)查和鑒定，并對所獲得的CMV基因組序列進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確CMV在洛陽地區(qū)蔬菜作物上的發(fā)生情況及株系鑒定，為該地區(qū)更好地進(jìn)行CMV的田間識別、選育抗病品種和抗病基因、制定有效的防控措施提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CMV調(diào)查樣品為2019年6—7月在洛陽市蔬菜種植區(qū)采集的茄科（辣椒、番茄）、豆科（四季豆、花生）和葫蘆科（南瓜、西葫蘆）等疑似病毒病樣品，主要表現(xiàn)癥狀有斑駁、花葉、線形葉和蕨葉。采集樣品于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

分子生物學(xué)試劑盒：RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-），植物總RNA提取試劑盒為TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；PCR擴(kuò)增試劑GreenTaqMix和DNA純化回收試劑盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit均購自南京諾唯贊生物科技有限公司（Vazyme Biotech Co., Ltd）。

1.2 總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增

1.2.1 檢測引物序列 應(yīng)用CMVCP片段的通用 檢 測 引 物 CMVCPuF/CMVCPuR［22］，可 擴(kuò) 增到 nt 1112-nt 1993（LC066518） 約 882 bp大 小的RNA3片段，包含完整的CP基因。并根據(jù)NCBI Genbank中CMVⅠ和CMVⅡRNA3基因組序列，在兩者變異較大的非保守基因組區(qū)間片段設(shè)計(jì)特異性檢測引物CMVⅠdF1/CMVⅠdR1和CMVⅡdF2/CMVⅡdR2，對采集的疑似病毒病蔬菜樣品進(jìn)行檢測。引物序列見表1。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增 利用植物總RNA提取試劑盒從疑似病毒病樣本中提取病株總RNA。反轉(zhuǎn)錄以提取的樣品總RNA為模板，使用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成病毒cDNA。體系為10 μL，具體方法為：將含2 μL模板，1 μL 檢測引物的下游引物（表1），3 μL ddH2O的混合樣混勻后，70 ℃下反應(yīng)10 min，迅速拿出放在冰上冷卻3 min，之后加入含2 μL 5×M-MLV Buffer，0.5 μL dNTP mix（10 mmol/L），0.5 μL RNase M-MLV，1 μL ddH2O 的混合液，在42 ℃反應(yīng)1 h，70 ℃下15 min反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)結(jié)束后立刻取出放置冰上待用。

表1 黃瓜花葉病毒檢測引物Table 1 Primers used for the detection of cucumber mosaic virus

PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL，具體方法為：取上述合成的 cDNA 1 μL，加入 3.6 μL ddH2O，5 μL GreenTaqMix，上、下游引物各 0.2 μL（表1）。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min；4 ℃終止反應(yīng)。配置1%瓊脂糖凝膠，反應(yīng)產(chǎn)物在凝膠電泳后放置紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3 PCR產(chǎn)物的回收及測序

將PCR擴(kuò)增獲得的目標(biāo)條帶參照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行純化回收，測序由擎科生物科技有限公司（北京）完成，測序結(jié)果由DNAStar7.0進(jìn)行編輯之后，提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）序列比對驗(yàn)證。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

用 MEGA7 軟件對獲得的CMVCP基因組核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用鄰接法（neighbourjoining，NJ），自展值（bootstrap）設(shè)為 1 000，系統(tǒng)進(jìn)化樹中只顯示自展值大于70%的結(jié)點(diǎn)。用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的參考序列分別為GenBank上具有代表性的CMV亞組Ⅰ和亞組Ⅱ基因組序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 洛陽田間蔬菜上CMV檢測結(jié)果

2019年在洛陽各地區(qū)采集蔬菜作物疑似病毒病樣品86份（表2），其中茄科蔬菜樣品44份（辣椒33、番茄11）、葫蘆科樣品21份（南瓜15、西葫蘆6）、豆科樣品21份（菜豆6、豇豆9、花生6）。用CMV通用檢測引物CMVCPuF/CMVCPuR對這些樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示在1份辣椒、5份番茄、4份菜豆和3份花生樣品中擴(kuò)增到大小約為882 bp的條帶（圖1 A）。其中檢測到CMV的幾份番茄、菜豆和花生分別在同一塊田中，各挑選1份辣椒、番茄、菜豆和花生樣品進(jìn)行測序，測序后經(jīng)NCBI Blast比對，這些分離物均與GenBank上CMV的序列同源性達(dá)到91.0%左右。為了進(jìn)一步確定所獲得的CMV分離物株系，分別對檢測到CMV的樣品再次用CMVⅠ和CMVⅡ特異性檢測引物進(jìn)行RT-PCR檢測驗(yàn)證，結(jié)果顯示CMVⅠ特異性引物在13個(gè)樣品中均擴(kuò)增出對應(yīng)的目標(biāo)條帶（圖1 B），而CMVⅡ特異性檢測引物未擴(kuò)增到對應(yīng)條帶（圖1 C），進(jìn)一步證明這些分離物為CMVⅠ亞組病毒。

CMV在所有檢測樣品中的檢出率為15.12%，其中在茄科樣品中的檢出率為13.64%，在豆科上的檢出率為33.33%，在番茄、花生和菜豆上的檢出率均較高，分別為45.45%、50.00%、66.67%（表2）。

表2 洛陽地區(qū)蔬菜作物上CMV檢測結(jié)果Table 2 Detection results of CMV on vegetable crops in Luoyang area

圖1 洛陽地區(qū)部分蔬菜樣品CMV（A）、CMV I（B）和CMV II（C）RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 CMV（A）, CMV I（B）and CMV II（C）amplification results of some vegetable samples in Luoyang area by RT-PCR

2.2 CMV在洛陽地區(qū)的田間表現(xiàn)癥狀

感染CMV的辣椒田間表現(xiàn)癥狀為花葉（圖2 A），番茄田間表現(xiàn)癥狀主要為蕨葉（圖2 B），菜豆表現(xiàn)癥狀為花葉、畸形和壞死（圖2 C），花生表現(xiàn)癥狀為花葉、黃化。

圖2 田間部分蔬菜作物上黃瓜花葉病毒的發(fā)生癥狀Fig. 2 Symptoms of CMV on some vegetables in fields

2.3 CMV CP基因核苷酸序列進(jìn)化分析及亞組鑒定

將獲得的大小約為657 bp的4個(gè)完整辣椒、番茄、菜豆和花生CMVCP基因核苷酸序列分別在NCBI上用Blast與GenBank中CMV的基因組序列比對分析，其中與100條CMV基因組核苷酸序列的比對結(jié)果表明，辣椒分離物CMVLYLJ核苷酸基因組序列與GenBank中CMV的基因組序列同源性在93.5%～95.2%之間，其中與中國草莓分離物（KT165229）和中國分離物K株系（AF127977）的同源性最高，均在95%以上。番茄分離物CMV-LYFQ核苷酸基因組序列與GenBank中CMV的基因組序列同源性在92.0%～97.9%之間，其中與中國煙草QZ分離物（EU414790）和HB24分離物（KC019301）中國的同源性最高，均在97%以上。菜豆分離物CMV-LYCD核苷酸基因組序列與GenBank中CMV的基因組序列同源性在91.0%～95.6%之間，其中與臺灣M48分離物（D49496）的同源性最高，為95%以上。花生分離物CMV-LYHS核苷酸基因組序列與GenBank中CMV的基因組序列同源性在93.6%～95.2%之間，和辣椒分離物相同，也是與中國草莓分離物（KT165229）和中國分離物K株系（AF127977）的同源性最高，在95%以上。

這4個(gè)CMV分離物中，CMV-LYLJ與CMVLYHS的CP基因組同源關(guān)系較近，其核苷酸同源性為96.9%，氨基酸同源性為94.4%。CMVLYFQ與CMV-LYCD的CP基因組同源關(guān)系較近，其核苷酸同源性為98.8%，氨基酸同源性為100%，而這兩個(gè)分離物與CMV-LYLJ和CMVLYHS的CP基因核苷酸序列同源關(guān)系相對較低，在90.8%～92.3%之間；氨基酸同源性相差不大，在93.8%～94.4%之間（表3）。

表3 洛陽4個(gè)CMV分離物CP基因核苷酸和氨基酸同源性比對Table 3 Homology comparison of nucleotide and amino acid of CP genes of four CMV isolates in Luoyang（%）

分別將辣椒分離物CMV-LYLJ、番茄分離物CMV-LYFQ、菜豆分離物CMV-LYCD和花生分離物CMV-LYHS與GenBank中有代表性的CMVⅠ和CMVⅡ亞組病毒分離物（表4）核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。進(jìn)化樹分析表明，在CMV分離物的兩個(gè)大類群中，本研究所獲得的4個(gè)CMV分離物（CMV-LYLJ、CMV-LYFQ、CMV-LYCD和CMV-LYHS）均分布在CMVⅠ亞組中，但CMV-LYFQ和CMV-LYCD分離物較CMV-LYLJ和CMV-LYHS基因組變異較大。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出，CMV基因組序列的變異進(jìn)化與地域和寄主均無直接相關(guān)性。

表4 用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的CMV序列Table 4 Information of CMV sequences used for phylogenetic tree analysis

圖3 基于CMV CP基因組核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CMV based on CP gene nucleotide sequences

3 討論

隨著小RNA測序技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等的逐漸推廣應(yīng)用，越來越多的新病毒被發(fā)現(xiàn)，目前我國蔬菜作物上報(bào)道的病毒至少有63種，在這些病毒中，CMV的檢出率最高［1］，為我國蔬菜作物上發(fā)生最廣泛、為害最大的病毒。本研究結(jié)果表明，CMV在洛陽地區(qū)的蔬菜作物上的發(fā)生也較為普遍，在辣椒、番茄、菜豆和花生上均已檢測出了CMV病毒，且檢出率較高。目前已知，CMV可以通過80多種蚜蟲或者摩擦等多種途徑進(jìn)行傳播［23］，因此，為避免將來因CMV在洛陽地區(qū)經(jīng)濟(jì)作物上的大暴發(fā)而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)提前在種植早期積極開展蚜蟲的防控措施，利用目前對CMV防控的研究成果進(jìn)行相關(guān)防控［24］，并積極在蔬菜作物上開展CMVⅠ的抗病育種等工作。

鑒定CMV亞組的方式有很多，但核苷酸基因組序列分析是目前公認(rèn)最可靠也是最有效的一種方法。CMV株系或分離物被分為CMVⅠ和CMVⅡ兩個(gè)亞組，在我國植株上這兩個(gè)亞組均已有報(bào)道，其中CMVⅠ的發(fā)生概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CMVⅡ［10-16］，而CMVⅠ的危害也遠(yuǎn)比CMVⅡ大［3,4,9,15］。在洛陽地區(qū)蔬菜作物上采集的樣品CMV病毒經(jīng)CMVⅠ和CMVⅡ兩個(gè)亞組特異性檢測引物檢測及CP核苷酸基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)均為CMVⅠ，暫無CMVⅡ，與我國大部分地區(qū)發(fā)生的CMV相似，以CMVⅠ為主。這說明CMVⅠ很可能是目前洛陽地區(qū)蔬菜作物上CMV病毒的優(yōu)勢亞組，但是，由于CMVⅡ感染作物的病發(fā)癥狀不夠明顯，因而采集過程中易被忽視；而且其本身穩(wěn)定性較差, 對溫度比較敏感，容易降解失活，在檢測過程中也易被丟失［15］，且本研究采集的樣品數(shù)量有限，因此，不排除沒有CMVⅡ發(fā)生的可能，應(yīng)繼續(xù)在本地區(qū)擴(kuò)展檢測范圍和數(shù)量，做好CMV的監(jiān)測工作。本研究中CMV亞組鑒定呈單一性的結(jié)果，一方面反映了CMVⅠ的適應(yīng)能力和變異能力強(qiáng)，同時(shí)也為洛陽地區(qū)提早做好對CMV的防控，培育CMVⅠ的抗性品種提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究分別利用CMVCP基因組的通用檢測引物及CMV亞組Ⅰ和亞組Ⅱ特異性檢測引物對采自洛陽地區(qū)有疑似病毒病癥狀的辣椒、番茄等主要茄科蔬菜作物，菜豆、豇豆等豆科作物以及南瓜、西葫蘆等葫蘆科蔬菜作物進(jìn)行鑒定，并結(jié)合對所獲得的CP基因核苷酸序列的分析結(jié)果，明確了CMV在洛陽地區(qū)辣椒、番茄、菜豆及花生幾種作物上的發(fā)生，并確定了CMV Ⅰ為主要發(fā)生株系。該研究結(jié)果暗示了應(yīng)在洛陽地區(qū)茄科和豆科蔬菜種植早期做好蚜蟲防控和抗病品種、抗病基因篩選鑒定等方面的工作。