魯中爽，許會會，蔡維北，武 悅，楊蓮花，王澤宇，王 楠，徐一鳴

（1.吉林和元生物工程技術(shù)創(chuàng)新研究開發(fā)有限公司，吉林 長春 130102；2.吉林元和元生物工程有限公司，吉林 長春 130102；3.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130102；4.吉林省畜牧獸醫(yī)工作總站，吉林 長春 130102）

【研究意義】非洲豬瘟病（African swine fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）導致的，能引起豬高度致死（死亡率可達100%）的急性傳染病［1-2］。我國是全球豬肉消費大國，養(yǎng)殖生豬總量占世界的50%，但我國養(yǎng)豬條件存在許多生物安全問題［3］。ASF由俄羅斯蔓延到我國，2018年8月我國首次報告ASF疫情［4-6］，之后ASF在我國多地迅速傳播，疫情形勢嚴峻復(fù)雜，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重打擊。由于ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜且容易變異［7-10］，至今還未有有效的ASF疫苗，因此掌握精確的ASF診斷方法顯得尤為重要。

【前人研究進展】ASFV是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，也是唯一的蟲媒DNA病毒［11］。研究證實，ASFV擁有龐大的基因組，基因組長約160～190 kb，含有約150個開放閱讀框，編碼160多種蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白50多種，如編碼病毒抗原表位的常見結(jié)構(gòu)蛋白P72（B646L）、P30（CP204L）、P54（E183L） 等［11-13］。ASFV 是通過細胞內(nèi)化作用進入自然感染的細胞中的，P30抗原蛋白也可能參與了病毒的內(nèi)化作用而進入細胞中。P30蛋白是由CP204L調(diào)控基因編碼的磷酸蛋白［13］，該蛋白在病毒感染早期，氨基末端絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化后被包進病毒粒子中。由于P30蛋白有良好的免疫原性，在動物體中容易產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生含量較高的抗體［14-16］，因此P30蛋白常被用做血清學診斷。

【本研究切入點】目前診斷和監(jiān)測ASFV感染豬群的重要方法是血清學檢測法。由于ASFV基因組較龐大，通過針對保守性、特異性好的蛋白進行血清學檢測，才能更快、更有效、更準確地實現(xiàn)診斷和監(jiān)測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】P30蛋白為穩(wěn)定蛋白，前人研究表明該蛋白是膜相關(guān)抗原蛋白，參與病毒內(nèi)化，具有較好的診斷抗原性。本研究以P30抗原蛋白作為血清學診斷試劑的主要研究蛋白，為后期ASFV感染后提供血清學檢驗基礎(chǔ)。以編碼P30蛋白的CP204L保守基因作為研究對象，并通過生物信息學分析，構(gòu)建表達重組載體及誘導蛋白表達，為P30蛋白的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ASFV基因組由軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良實驗室惠贈。pET-32a（+）、pEASY-T5 Zero Cloing Kit、2×Rapid Taq Master Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司；E. coliDH5α、Rosetta（DE3）、xHoⅠ、EcoRⅠ、T4DNA Ligase、Maker購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒試劑盒、膠回收試劑盒購于康寧生命科學有限公司。

1.2 基因克隆

根據(jù)NCBI中CP204L基因序列（登錄號：MN172368.1）設(shè)計特異性引物（CP204L-F：CCGGAATTC ATGGATTTTATTTTAAATATATCC，CP204L-R：CCGCTCGAG TTATTTTTTTTTTAAAA GTTTAAT），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司長春分公司合成。以ASFV基因組作為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL Mix，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，6 μL ddH2O，2 μL模板；PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性 15 s、58 ℃退火 15 s、72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；72℃后延伸5 min。

1.3 克隆載體構(gòu)建與鑒定

對PCR擴增出來的目的條帶進行切膠，并用膠回收試劑盒進行回收，將回收的PCR產(chǎn)物片段連接pEASY-T5克隆載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)中并涂布在含有卡那抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8～10 h后對挑取單菌落搖菌，并進行菌液PCR驗證，將驗證成功的菌液進行測序比對。

1.4 生物信息學分析

采用TExpasy方法對蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)預(yù)測；分別采用Tmpred、HMM方法對蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)進行預(yù)測；采用SignalP方法進行信號肽預(yù)測；采用PSIPRED方法進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；采用SWISS-MODEL方法進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.5 重組表達載體構(gòu)建與鑒定

用xHoⅠ和EcoRⅠ將pET-32a（+）表達載體和pEASY-T5-CP204L克隆載體分別進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠，pET-32a（+）載體大片段和目的基因片段用凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物用T4DNA Ligase在16 ℃下過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，在含卡那抗性的LB培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)，進行抗性篩選，挑取單菌落進行搖菌提質(zhì)粒，進行質(zhì)粒PCR驗證、雙酶切驗證及測序比對驗證。

1.6 重組蛋白的誘導表達

將鑒定正確的重組載體pET-32a（+）-CP204L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞中，次日挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，次日取200 μL菌液接種于20 mL含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，加入1.0 mmol/L IPTG誘導8 h，收集菌液。

1.7 重組蛋白的SDS-PAGE電泳鑒定

將收集的菌液在12 000 r/min條件下離心1 min，收集菌體，用PBS沖洗2次后進行超聲破碎10 min，期間超聲破碎10 s、間歇10 s，重復(fù)進行，電壓220 V，10 000 r/min離心后分別取上清和沉淀，將沉淀用PBS重懸后重新稀釋，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因擴增

利用特異性引物進行CP204L基因擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在585 bp處有明亮的條帶（圖1），結(jié)果與預(yù)期相符。

圖1 CP204L基因克隆結(jié)果Fig. 1 Cloning result of CP204L gene

2.2 克隆載體構(gòu)建及鑒定

圖2 菌液PCR驗證Fig. 2 PCR verification of bacterial solution

將目的基因PCR產(chǎn)物用DNA產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收，將目的基因片段與pEASY-T5載體連接并轉(zhuǎn)化，挑取單菌落擴大培養(yǎng)，進行菌液PCR驗證，將圖2目的條帶的菌液送往上海生工有限公司測序。使用DNAMAN軟件對測序結(jié)果與CP204L基因序列進行比對分析，結(jié)果顯示測序結(jié)果與CP204L基因序列同源性為100%，證明CP204L基因與克隆載體連接成功。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 蛋白理化性質(zhì) TExpasy在線預(yù)測分析結(jié)果顯示，CP204L基因編碼195個氨基酸，序列如下：

MDFILNISMK MEVIFKTDLR

SSSQVVFHAG SLYNWFSVEI

INSGRIVTTA IKTLLSTVKY

DIVKSARIYA GQGYTEHQAQ

EEWNMILHVL FEEETESSAS

SENIHEKNDN ETNECTSSFE

TLFEQEPSSE VPKDSKLYML

AQKTVQHIEQ YGKAPDFNKV

IRAHNFIQTI YGTPLKEEEK

EVVRLMVIKL LKKK*

P30蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為34.12，為穩(wěn)定蛋白；總親水性平均值為0.739，為親水蛋白。

2.3.2 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測 基于對Tmbase數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計分析預(yù)測P30蛋白的跨膜區(qū)和跨膜方向，用Tmpred法分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，結(jié)果（圖3）顯示，P30蛋白TM-螺旋長度都在17～33之間；基于HMM方法預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，圖4顯示TMH數(shù)量為0，P30蛋白為非跨膜蛋白。

2.3.3 蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測 采用SignalP在線軟件對P30蛋白進行信號肽預(yù)測，結(jié)果（圖5）顯示，基因編碼的P30蛋白在編碼區(qū)內(nèi)均無有信號肽信號，說明該蛋白不是分泌性蛋白。

圖3 Tmpred法蛋白跨膜域分析Fig. 3 Transmembrane domain analysis of protein by Tmpred method

圖4 HMM法蛋白跨膜域分析Fig. 4 Transmembrane domain analysis of protein by TMM method

圖5 P30蛋白信號肽分析Fig. 5 Analysis of protein signal peptide

2.3.4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 PSIPRED法在線預(yù)測分析P30蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖6）顯示，該蛋白主要結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲、α螺旋和β折疊組成。

2.3.5 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過SWISSMODEL在線預(yù)測P30蛋白質(zhì)同源建模結(jié)構(gòu)（圖7），無規(guī)則卷曲、α螺旋和β折疊是三級結(jié)構(gòu)的主要成分，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。

2.4 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

用EcoRⅠ、xHoⅠ酶同時將構(gòu)建好的克隆載體和表達載體pET-32a（+）質(zhì)粒進行雙酶切驗證，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖8、圖9）顯示，酶切產(chǎn)物可獲得目的基因片段和載體片段，將基因片段和線性載體大片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行切膠回收。

圖6 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 6 Analysis of the secondary structure of protein

圖7 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig. 7 Prediction result of the tertiary structure of protein

用T4連接酶連接目的基因CP204L與pET-32a（+）載體大片段構(gòu)建重組表達載體pET-32a（+）-CP204L并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，對轉(zhuǎn)化后的單菌落進行菌液PCR驗證，對驗證成功的提取pET-32a（+）-CP204L質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與目的基因序列一致，證明重組表達載體pET-32a（+）-CP204L構(gòu)建成功（圖10、圖11）。

2.5 P30蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測

圖8 CP204L基因克隆載體質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig. 8 Cloning vector plasmid of CP204L gene verified by double digestion

重組原核表達質(zhì)粒pET-32a（+）-CP204L轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，37℃經(jīng)IPTG誘導后菌體超聲破碎，上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳。由圖12可知，pET-32a（+）-CP204L以可溶形式在宿主菌中未表達，以質(zhì)溶形式在沉淀中有表達。蛋白分子質(zhì)量約為23.4 ku，與理論值相符。

圖9 pET-32a（+）表達載體質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig. 9 Identification of expression vector plasmid pET-32a（+）by double digestion

圖10 菌液PCR驗證Fig. 10 PCR verification of bacterial solution

圖11 pET-32a（+）-CP204L重組表達載體示意圖Fig. 11 Schematic diagram of pET-32a（+）-CP204L recombinant expression vector

圖12 P30蛋白SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig. 12 SDS-PAGE detection results of P30 protein

3 討論

ASF是一類發(fā)病機理和臨床癥狀極為復(fù)雜的傳染病，如不能及早發(fā)現(xiàn)和實施嚴格控制措施會迅速蔓延和持續(xù)傳播，將對社會造成嚴重經(jīng)濟損失［17-18,22］。ASF可根據(jù)流行病學、臨床癥狀和病理特點作出初步判斷，但最終需根據(jù)實驗室診斷結(jié)果進行確診。雖然目前市場上沒有有效的疫苗，國內(nèi)外的研究人員也從未停止對非洲豬瘟的研究。吳競等［19］通過P30蛋白的原核表達建立了間接ELISA檢測方法；Alexandra等［20］對P30基因進行CRISPR/Cas9靶向編輯后，有效抑制了ASFV病毒的復(fù)制；李杰等［5］將ASFV的P30-54融合蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達，該重組蛋白可以與多克隆抗體發(fā)生免疫學反應(yīng)；楊莎莎等［22］制備了非洲豬瘟pET-28a-P30單克隆抗體，為ASFV的診斷和致病機制研究奠定基礎(chǔ)。

前人諸多研究表明，P30蛋白是ASFV中的關(guān)鍵蛋白，具有良好的反應(yīng)原性，吳競等［19］建立的ELISA檢測方法表明，克隆和表達P30蛋白可以用來監(jiān)測ASF疫情；Alexandra等［20］對P30蛋白重新編輯之后，抑制了ASFV蛋白的表達，因此可以通過調(diào)控P30蛋白來控制ASFV病毒的致病性；楊莎莎等［21］選用Georgia2007/1毒株基因組也成功構(gòu)建了單克隆抗體，更能判定P30蛋白的表達在建立間接ELISA方法應(yīng)用于監(jiān)測疫情是可行的，而且非常重要。前人的研究缺少在生物信息學方面進行蛋白的分析，結(jié)合蛋白層面的分析能夠更好地了解蛋白及分析蛋白功能，這些對后期研究具有重要意義。本試驗對ASFV調(diào)控蛋白P30進行了研究，在生物信息學層面對CAS19-01株病毒中的CP204L基因組進行剖析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建表達載體并誘導其成功表達P30蛋白，為制備檢測試劑盒做好準備。

4 結(jié)論

ASFV基因組可編碼的蛋白非常多，而且ASFV的免疫逃避機制復(fù)雜，使得非洲豬瘟疫苗的研發(fā)工作受阻。未來需要繼續(xù)深入研究ASFV的病原學、致病機理和免疫機制，才能更好地應(yīng)對疫情發(fā)生。目前非洲豬瘟疫苗開始進入臨床階段，對疫病的抗體檢測迫在眉睫，為了加快自主研發(fā)的步伐，盡快研制出高效且靈敏的抗體檢測試劑盒尤為關(guān)鍵。本研究根據(jù)CAS19-01株病毒基因組成功克隆了在ASFV中穩(wěn)定存在、保守的CP204L基因，并成功構(gòu)建其表達載體pET-32a（+）-CP204L，通過用IPTG誘導8 h后成功表達蛋白，為制備ASF的抗體檢測試劑提供技術(shù)基礎(chǔ)。