陳凱凱 張 成 趙 菲 王 馳 王孝成 耿照玉 姜潤(rùn)深

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

成肌細(xì)胞(Myoblast)來(lái)源于中胚層干細(xì)胞，是胞漿中含有肌絲的肌組織前體細(xì)胞，具有自我更新、促進(jìn)肌纖維再生以及多向分化等能力。成肌細(xì)胞大量增殖后融合為多核肌管，最終分化為成熟的多核肌纖維[1-2]，對(duì)骨骼肌發(fā)育、修復(fù)和再生起著重要作用[3]。成肌細(xì)胞作為一種多能干細(xì)胞，未退出細(xì)胞周期，具有增殖分化潛能大、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因而受到廣泛關(guān)注，被作為肌肉發(fā)育[4]、肌肉疾病[5]及營(yíng)養(yǎng)調(diào)控[6]等研究的理想體外模型。

成肌細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)可追溯至1961年，Mauro[7]利用電鏡技術(shù)首次從青蛙骨骼肌中發(fā)現(xiàn)并分離獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，是成體內(nèi)未激活的成肌細(xì)胞。Spencer等[8]利用大鼠成肌細(xì)胞研究生長(zhǎng)抑素對(duì)胰島素刺激的細(xì)胞氨基酸攝取功能的影響；Yang等[9]以豬成肌細(xì)胞為試驗(yàn)材料研究Wnt/b-catenin信號(hào)通路對(duì)肌源性分化的影響。以上研究充分體現(xiàn)了成肌細(xì)胞在肌肉發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)調(diào)控信號(hào)通路等研究中的重要作用。目前，包括人[10]在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物，如大鼠[8]、小鼠[11]、豬[9]、綿羊[12]以及山羊[13]等均已建立了成熟的原代成肌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法。但禽類(lèi)生理特征不同于哺乳動(dòng)物，如成年雞的體溫達(dá)到41.5 ℃[14]，遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物，導(dǎo)致肉雞骨骼肌成肌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)比較困難，進(jìn)而限制了家禽肌肉發(fā)育及其營(yíng)養(yǎng)調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究。因此，亟需建立一種肉雞成肌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法。本研究擬以肉雞雞胚為研究材料，旨在建立一種以肉雞雞胚為來(lái)源的成肌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定體系，為進(jìn)一步研究肉雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及其營(yíng)養(yǎng)調(diào)控機(jī)制提供研究模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮淮南麻黃雞受精蛋，購(gòu)于安徽某孵化場(chǎng)。

膠原酶Ⅰ型(Sigma)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma)、PBS緩沖液(Hyclone)、胎牛血清(Clark)、青霉素-鏈霉素溶液(100×，Biosharp)、胰蛋白酶溶液(0.25%，Hyclone)、馬血清(Hyclone)、細(xì)胞培養(yǎng)板/瓶(Costar)、CCK-8試劑(Biosharp)、DMSO(Sigma)、RNAiso Plus(TaKaRa)、cDNA第一鏈合成試劑盒(ABclonal)、2X SYBR Green 快速qPCR混合液(ABclonal)、一抗Desmin(Servicebio)、一抗MyHC(Santa Cruz)、FITC標(biāo)記二抗(山羊抗小鼠，Servicebio)和CY3標(biāo)記二抗(山羊抗兔，Servicebio)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1主要培養(yǎng)基配制

增殖培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基中添加20%胎牛血清，1%青-鏈霉素混合液；

分化培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基中添加2%馬血清，1%青-鏈霉素混合液。

1.2.2成肌細(xì)胞的分離

取11 d胚蛋，于75%酒精中浸泡殺菌5 min，移入超凈工作臺(tái)自然干燥后取出雞胚，用含雙抗的PBS洗2次后分離胸部肌肉，肌肉組織經(jīng)PBS洗2次后剪成1 mm3不規(guī)則碎片，PBS清洗1次后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，1 000 r/min離心6 min，棄上清，采用0.1% Ⅰ型膠原酶重懸沉淀，于37 ℃水浴消化，每隔5 min搖勻1次，當(dāng)消化液中出現(xiàn)一團(tuán)松散白色絮狀物時(shí)，加入增殖培養(yǎng)基終止消化，吹打至單細(xì)胞懸液，靜置1 min后取上清液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾至新離心管中，1 000 r/min離心6 min，去除上清，收集沉淀，重懸于PBS中，吹打混勻，400目篩網(wǎng)重復(fù)上一步驟后，重懸于增殖培養(yǎng)基中。

1.2.3成肌細(xì)胞的純化培養(yǎng)

細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔板(左側(cè)2孔)中，十字搖勻法使細(xì)胞分布均勻，標(biāo)記時(shí)間后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，吸取未貼壁細(xì)胞至第2排孔，重復(fù)3次差速貼壁后進(jìn)行增殖培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度增殖至70%時(shí)，及時(shí)進(jìn)行傳代處理，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，每孔(六孔板)加入0.25%胰酶0.5 mL，20 s后吸去胰酶，置于CO2培養(yǎng)箱中3 min，隨后用增殖培養(yǎng)基終止消化，吹打懸液使未漂浮細(xì)胞脫落。為保證成肌細(xì)胞純度，每次傳代后進(jìn)行一次差速貼壁，通過(guò)觀察30 min貼壁的成纖維細(xì)胞數(shù)判斷成肌細(xì)胞純度。經(jīng)觀察，純化至第3代，在30 min內(nèi)無(wú)細(xì)胞貼壁。因此，后續(xù)試驗(yàn)采用第3代成肌細(xì)胞。

1.2.4成肌細(xì)胞適宜培養(yǎng)溫度的確定

取第3代成肌細(xì)胞按相同密度接種至兩塊96孔板中，分別隨機(jī)選取5孔添加CCK-8試劑10 μL/孔，置于37.0 ℃ 1 h后，于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，隨后2板分別置于37.0 ℃與39.5 ℃的CO2培養(yǎng)箱中，每天以相同方法測(cè)定吸光度，用OD值表示繪制細(xì)胞增殖曲線，比較2培養(yǎng)溫度下細(xì)胞增殖狀態(tài)，用細(xì)胞活力表示細(xì)胞增殖狀態(tài)。

第n天細(xì)胞活力=[OD(第n天)-OD(空白)]/ [OD(第0天)-OD(空白)]×100%

1.2.5成肌細(xì)胞的成肌誘導(dǎo)分化

當(dāng)細(xì)胞密度增殖至80%時(shí)，棄去增殖培養(yǎng)基，PBS洗2次，換成含2%馬血清的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)成肌分化，每天換液，觀察成肌細(xì)胞及肌管生長(zhǎng)分化情況。

1.2.6成肌細(xì)胞增殖及分化階段特異性表達(dá)基因鑒定

細(xì)胞增殖至80%時(shí)及誘導(dǎo)分化3 d后，棄去培養(yǎng)基，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)合格后采用兩步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用NCBI primer-BLAST設(shè)計(jì)目標(biāo)基因的引物，委托通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。采用ABI7500定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。

表1 RT-qPCR 引物信息Table 1 Primer information for RT-qPCR

1.2.7成肌細(xì)胞Desmin與成肌誘導(dǎo)分化后MyHC免疫熒光鑒定

取純化至第3代的成肌細(xì)胞接種至含細(xì)胞爬片的6孔板中，39.5 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至適宜密度，取出細(xì)胞爬片至平皿中，PBS洗3次；4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，每次5 min(后續(xù)PBS洗滌均為3次，5 min/次)；加入1 ml 0.1%Triton X-100，室溫孵育15 min，PBS洗滌；加入1% BSA(牛血清白蛋白)溶液，室溫封閉1 h；吸去BSA，直接加入一抗Desmin(1% BSA，1∶500稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌；加入CY3標(biāo)記的二抗，避光室溫孵育1 h，PBS洗滌；DAPI染核5 min，PBS洗滌；取出細(xì)胞爬片，將其倒扣在滴加抗熒光猝滅封片劑的載玻片上，熒光顯微鏡觀察并拍照。取成肌分化誘導(dǎo)5 d后的爬片進(jìn)行MyHC免疫熒光鑒定，一抗為MyHC，二抗為FITC標(biāo)記，其他步驟同上。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 成肌細(xì)胞的分離純化及形態(tài)特征

使用Ⅰ型膠原酶消化雞胚胸肌，并經(jīng)過(guò)3次差速貼壁方法去除大部分的成纖維細(xì)胞，傳至第3代培養(yǎng)30 min后未見(jiàn)成纖維細(xì)胞貼壁。因此，經(jīng)3代純化，成肌細(xì)胞純度即可滿足試驗(yàn)需要。第3代純化得到的成肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后觀察，大部分細(xì)胞已貼壁，呈現(xiàn)紡錘形或細(xì)長(zhǎng)梭形(圖1(a))，之后細(xì)胞迅速增殖，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)，細(xì)胞呈螺旋或平行排列(圖1(b))。

圖1 成肌細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 Myoblast morphology

2.2 成肌細(xì)胞在不同溫度培養(yǎng)條件下的增殖曲線

圖2 不同培養(yǎng)溫度下肉雞成肌細(xì)胞的增殖曲線(n=5)Fig.2 Proliferation curves of broiler myoblasts at different culture temperature (n=5)

由圖2可知，肉雞成肌細(xì)胞在37.0 ℃及39.5 ℃均能生長(zhǎng)，但39.5 ℃的增殖速率高于37.0 ℃。相同接種密度，39.5 ℃培養(yǎng)條件下，細(xì)胞增殖至平臺(tái)期(部分成肌細(xì)胞已分化成肌管)需要4 d，而37.0 ℃需要6～7 d；同時(shí)在換液時(shí)發(fā)現(xiàn)37.0 ℃培養(yǎng)條件下漂浮的死細(xì)胞數(shù)多于39.5 ℃，因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇 39.5 ℃ 作為肉雞成肌細(xì)胞的培養(yǎng)溫度。

2.3 成肌細(xì)胞增殖及分化階段特異性表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量分析

經(jīng)RT-qPCR分析，增殖期與分化期均有成肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志基因Myf5與MyoD的表達(dá)，初步證明該細(xì)胞為成肌細(xì)胞；與增殖期相比，分化期細(xì)胞MyoG與MRF4基因表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(圖3)，表明成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化效果顯著。

2.4 成肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白Desmin的表達(dá)檢測(cè)

經(jīng)免疫熒光分析，Desmin蛋白經(jīng)CY3標(biāo)記在綠色熒光激發(fā)后呈紅色(圖4(a))，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色在紫外光激發(fā)后呈藍(lán)色(圖4(b))，Desmin陽(yáng)性率在95%以上(圖4(c))。此結(jié)果充分表明此方法分離純化的細(xì)胞為成肌細(xì)胞，且純度高，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 成肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化后標(biāo)志蛋白MyHC的表達(dá)檢測(cè)

當(dāng)細(xì)胞換成含2%馬血清的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)成肌分化1 d后，細(xì)胞形態(tài)較分化前體積增大，界限開(kāi)始模糊，部分細(xì)胞發(fā)生融合，細(xì)胞方向性排列更加明顯；誘導(dǎo)分化3 d后，形成具有多核的肌小管，部分肌管發(fā)生無(wú)規(guī)則搏動(dòng)；誘導(dǎo)分化5 d后，肌管進(jìn)一步融合，形成方向性更加明顯的長(zhǎng)肌管(未在結(jié)果中顯示)。肌球蛋白重鏈(MyHC)是肌肉的主要結(jié)構(gòu)和收縮蛋白之一，可作為鑒定成肌細(xì)胞分化標(biāo)志。取誘導(dǎo)分化5 d的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)MyHC的表達(dá)情況，MyHC經(jīng)FITC標(biāo)記在藍(lán)色熒光激發(fā)后呈綠色，由圖5可知，MyHC在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)。此結(jié)果表明此方法分離的成肌細(xì)胞有較好的成肌分化潛能，且2%的馬血清分化培養(yǎng)基適合肉雞成肌細(xì)胞的分化。

3 討 論

3.1 成肌細(xì)胞的分離方法

成肌細(xì)胞作為一種多能干細(xì)胞，其數(shù)量和功能會(huì)隨著發(fā)育的完善逐漸降低。因此，分離時(shí)間的選擇十分重要[15]。很多學(xué)者在分離豬及羊等哺乳動(dòng)物的成肌細(xì)胞時(shí)，常選的時(shí)期是出生后[11,13]。雞作為卵生動(dòng)物，8～12 d的雞胚已形成了雞的雛形，能分辨出皮膚、肌肉及軟骨等組織，且該時(shí)期為成肌細(xì)胞快速增殖期，成肌細(xì)胞含量較高，雞胚肌肉發(fā)育主要集中在胸部和腿部，但腿部組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血管豐富，分離時(shí)容易混入血管上皮細(xì)胞、血細(xì)胞等雜細(xì)胞，而胸部肌肉較腿部更為發(fā)達(dá)[16]，且組織結(jié)構(gòu)更為單一。綜合組織分離難度以及肌肉組織量等多方面因素，本研究選取了11 d雞胚的胸部肌肉，作為肉雞成肌細(xì)胞的細(xì)胞來(lái)源。

*表示存在差異性顯著(P<0.05)。 * means significant difference (P<0.05).圖3 生肌調(diào)節(jié)因子家族(MRFs)mRNA的表達(dá)水平(n=5)Fig.3 mRNA expression levels of muscle regulatory factors (MRFs) (n=5)

成肌細(xì)胞的分離方法有多種，目前較為成熟的方法包括組織塊法、酶消化法和單根肌纖維法等[17]。酶消化法因其操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞分離徹底等優(yōu)點(diǎn)受到很多學(xué)者的青睞。目前，成肌細(xì)胞分離方法主要是基于Blau等[18]建立的胰蛋白酶與膠原酶聯(lián)合分步消化法。胰酶活性強(qiáng)，對(duì)濃度及消化時(shí)間都有嚴(yán)格要求，容易損傷細(xì)胞膜上的功能蛋白[19]，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳甚至死亡；而膠原酶消化則相對(duì)溫和，對(duì)細(xì)胞的損傷較小。因雞胚發(fā)育中期，肌肉排列不緊密，本研究?jī)H采用Ⅰ型膠原酶作為消化酶。此法步驟簡(jiǎn)單，減少了消化酶對(duì)細(xì)胞的損傷，且分離的細(xì)胞數(shù)量以及活力可滿足試驗(yàn)需求。

3.2 成肌細(xì)胞的純化方法

目前成肌細(xì)胞的純化分離方法有差速貼壁法、梯度離心法、流式細(xì)胞分選法和免疫磁珠分選法等[17]，其中差速貼壁法和梯度離心法較為常用。Hindi等[20]利用差速貼壁法(差速貼壁45 min)純化從成年小鼠骨骼肌中分離的細(xì)胞后成功獲得成肌細(xì)胞；孫文娟[21]從新生仔豬骨骼肌中分離的慢速貼壁細(xì)胞(差速貼壁2 h后)，經(jīng)成肌誘導(dǎo)后形成多核肌管；王紅娜等[12]采用差速貼壁法及梯度離心法純化綿羊成肌細(xì)胞，認(rèn)為此2種方法純化程度相當(dāng)，但梯度離心法更為繁瑣。流式細(xì)胞分選法、免疫磁珠分選法受設(shè)備要求高、試劑價(jià)格高等原因的影響，使用不廣泛。因此，本研究采用差速貼壁法純化肉雞成肌細(xì)胞，并在每次傳代時(shí)均利用該方法去除殘余的成纖維細(xì)胞，成功獲得了純度95%以上的成肌細(xì)胞。

3.3 成肌細(xì)胞的增殖培養(yǎng)條件和成肌分化培養(yǎng)條件

肉雞屬于禽類(lèi)，其生理特征有別于哺乳動(dòng)物，就體溫而言，成年雞的正常體溫為41.5 ℃[14]，遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物。然而，對(duì)于禽類(lèi)細(xì)胞的體外培養(yǎng)溫度，絕大部分學(xué)者選擇37.0 ℃，僅有部分學(xué)者選擇在更接近雞正常體溫的溫度條件下培養(yǎng)禽類(lèi)細(xì)胞，如劉晴雪等[22]在39.0 ℃條件下培養(yǎng)了雞淋巴細(xì)胞。初生雛雞體溫較成年雞低2.0～3.0 ℃[23]，本研究成肌細(xì)胞來(lái)源于雞胚，因而選取更接近雛雞正常體溫的39.5 ℃與培養(yǎng)細(xì)胞常選擇的37.0 ℃進(jìn)行比較。研究表明，在39.5 ℃的培養(yǎng)溫度下，肉雞成肌細(xì)胞增殖速度顯著高于37.0 ℃，細(xì)胞狀態(tài)更好。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇39.5 ℃作為肉雞成肌細(xì)胞的培養(yǎng)溫度。大多數(shù)細(xì)胞在低濃度的血清中可退出細(xì)胞周期[24]，2%的馬血清可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞成肌分化[25]。本試驗(yàn)使用2%馬血清成功誘導(dǎo)了成肌細(xì)胞融合形成多核肌管。

圖4 肉雞成肌細(xì)胞Desmin免疫熒光鑒定Fig.4 Immunofluorescence identification of Desmin in broiler myoblasts

圖5 肉雞成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化后標(biāo)志蛋白MyHC免疫熒光鑒定Fig.5 Immunofluorescence identification of MyHC after differentiation of broiler myoblasts

3.4 成肌細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化

骨骼肌的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受許多基因的調(diào)控，其中生肌調(diào)節(jié)因子家族(MRFs)，包括MyoD、Myf5、MyoG及MRF4在其中發(fā)揮了重要作用，是肌肉發(fā)育的特異性調(diào)控因子[26]。研究表明，MyoD和Myf5決定肌源性細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)具有開(kāi)啟成肌細(xì)胞分化的重要功能，在成肌細(xì)胞的增殖期具有較高表達(dá)水平[27-28]；MRF4和MyoG在肌細(xì)胞的融合與肌纖維的終末分化中起作用。因此，MyoD和Myf5可作為增殖期的標(biāo)志蛋白，MyoG和MRF4可作為分化期的標(biāo)志蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，增殖期與分化期均有成肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白Myf5與MyoD表達(dá)，且與增殖期相比，MyoD基因表達(dá)顯著下降，初步證明所分離的細(xì)胞為成肌細(xì)胞，誘導(dǎo)分化3 d后MyoG和MRF4基因表達(dá)與增殖期相比顯著升高，說(shuō)明成肌誘導(dǎo)分化方法有效。

結(jié)蛋白(Desmin)是一種中間絲蛋白，是肌細(xì)胞特有的細(xì)胞骨架之一[29]，而成纖維細(xì)胞則不表達(dá)此蛋白。因此，常用Desmin作為鑒定成肌細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。肌球蛋白是骨骼肌中的結(jié)構(gòu)蛋白和收縮蛋白，而肌球蛋白重鏈(MyHC)是其重要的組成部分[30]。因此，常用MyHC作為鑒定成肌細(xì)胞分化的標(biāo)志蛋白。經(jīng)免疫熒光鑒定，本研究分離純化的成肌細(xì)胞增殖期Desmin蛋白呈陽(yáng)性，而分化5 d后MyHC在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈顯著的陽(yáng)性表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了本研究分離的肉雞成肌細(xì)胞的純度高，且誘導(dǎo)分化效果好。

4 結(jié) 論

利用單一的膠原酶Ⅰ消化法及差速貼壁法從肉雞雞胚中成功分離獲得了成肌細(xì)胞，且在39.5 ℃培養(yǎng)條件下具有更好的增殖能力，為進(jìn)一步研究肉雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)調(diào)控機(jī)制提供了體外細(xì)胞模型。