鄧雪冰，張江霖，廖 英，鄒 艷，尹艷華，陶曉群

（1.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校，株洲 412007；2.湖南省婦幼保健院婦保科，長沙 410000）

卵巢衰老是卵巢儲備功能逐漸下降直至最后衰竭的過程，受多種因素的影響[1-3]。除年齡外，外界環(huán)境、遺傳因素、生活方式、社會心理、免疫等都可通過直接或間接途徑影響卵巢功能，導致卵巢功能下降。近年來，發(fā)現(xiàn)卵巢早衰和卵巢儲備下降的病人呈不斷上升及年輕化的趨勢［4-6］。原因之一可能是女性對內(nèi)分泌疾病的重視及臨床診斷水平的提高，其二可能是與現(xiàn)代女性生活方式有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒、吸毒是影響女性卵巢儲備功能的常見因素［7-9］。但目前各種行為方式對卵巢功能的影響權(quán)重及影響機制仍不明確，如何去趨利避害以最大限度保護女性卵巢功能具有重要的研究意義。因此本實驗予不同濃度酒精灌胃雌鼠不同的時間，制造雌鼠飲酒模型，通過檢測外周血清性激素含量和稱量卵巢濕重，從而探討酒精對卵巢功能損傷的規(guī)律及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物40只健康成年SD雌性大鼠，采購于湖南長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，體重為200～220g之間，給予足夠的水和食物。飼養(yǎng)條件：房間溫濕度適宜，持續(xù)日光燈照射，溫度為24℃，濕度為60%。

1.1.2 試劑與設(shè)備試劑為10%、20%、30%的酒精（配置方法：10%酒精：15mL 99%酒精加135mL 蒸餾水配至150mL ；20%酒精：30mL 99%酒精加120mL 蒸餾水配至150mL ；30%酒精：45mL 99%酒精加105mL 蒸餾水配至150mL ）；卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、抗苗勒管激素（AMH）、抑制素B（INH-B）試劑檢測盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：DNM-9606型酶標分析儀、ES-1000E電子天平。

1.2 方法

1.2.1 分組按隨機數(shù)字法將40只大鼠分為 4 組，分別為10%酒精組（低濃度組）、20%酒精組（中濃度組）、30%酒精組（高濃度組）及對照組（蒸餾水組）。

1.2.2 動物模型制備研究組大鼠予 10%、20%、30%酒精2mL灌胃，早晚各1次，對照組予等體積的蒸餾水灌胃，方法與研究組相同。灌胃4周后每組隨機處死5只SD大鼠，余下的20只大鼠繼續(xù)灌胃至8周處死。

1.3 組織標本制備［10］雌鼠飲酒模型建立后，四組SD大鼠在麻醉的狀況下斷頭摘眼球后取血，取血5mL于促凝管中，室溫下自然凝固，離心機離心，取上方血清，用ELISA法（雙抗夾心法）測定抗苗勒試管激素（AMH）、抑制素B（INH-B）、 卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）；然后取大鼠的臟器雙側(cè)卵巢，用電子天平稱重。

1.4 統(tǒng)計學分析計量資料采用均數(shù)±標準差表示。組間比較采用多樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用獨立樣本t檢驗，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均輸入SPSS 18.0 軟件，通過軟件包進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為有顯著差異性。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度酒精灌胃對大鼠血清FSH、E2的影響

灌胃4周時，30%酒精組的血FSH、E2水平顯著高于其他三組（P＜0.05），10%、20%酒精組血FSH、E2無顯著變化（P＞0.05）。灌胃8周時，三種酒精組的FSH均升高，且較同濃度組4周時高（P＜0.05）。30%酒精組E2水平較灌胃4周時顯著下降（P＜0.05）；而10%和20%酒精組E2水平較4周時顯著升高（P＜0.05），且較對照組和同期30%酒精組明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 不同濃度酒精灌胃雌鼠后血清FSH、E2水平比較（n=5）

2.2 不同濃度酒精灌胃后對大鼠血清AMH、INH-B的影響灌胃4周時，20%、30%酒精組血AMH、INH-B明顯低于對照組（P＜0.05），而10%的酒精組AMH、INH-B無顯著變化（P＞0.05）。灌胃8周時，三種濃度酒精組 AMH、INH-B 均顯著降低（P＜0.05），且比灌胃4周時更低（P＜0.05），見表 2。

表2 不同濃度酒精灌胃雌鼠后血清AMH、 INH-B水平比較（n=5）

2.3 不同濃度酒精灌胃對卵巢濕重的影響灌胃4周時，30%酒精組的雙側(cè)卵巢濕重明顯高于其他三組（P＜0.05），而灌胃8周時，大鼠雙側(cè)卵巢濕重較4周時減輕（P＜0.05）；灌胃8周時10%和20%酒精組雙側(cè)卵巢濕重較4周時顯著升高（P＜0.05），并且高于同期 30%酒精組和對照組的卵巢濕重，有顯著性差異（P＜0.05），見表3。

表3 不同濃度組大鼠卵巢濕重情況比較及同濃度組內(nèi)前后比較（n=5）

3 討論

臨床上評價卵巢儲備功能的指標主要有：年齡、AMH、卵巢體積、雙側(cè)竇卵泡數(shù)目、FSH、E2、INH-B等［11］。年齡一直被認為是預測卵巢儲備功能最重要指標之一，隨著年齡增長，女性卵巢儲備能力不斷下降［12］。卵巢體積、質(zhì)量及竇卵泡數(shù)也是反映卵巢功能的重要指標，國際上普遍用竇卵泡數(shù)量來評定卵巢功能，卵巢體積、質(zhì)量與竇卵泡數(shù)量有相關(guān)性［13］。血清FSH、E2水平是臨床上評價卵巢儲備能力的常用指標［14］，卵巢功能減退的早期表現(xiàn)E2水平上升，隨之出現(xiàn)下降，血FSH水平上升，較其它癥狀出現(xiàn)較早。INH-B是由竇前卵泡和竇卵泡分泌的糖蛋白類激素，臨床研究表明，INH-B的下降早于FSH的升高，能更早期反應(yīng)卵巢儲備功能，在臨床運用越來越廣泛［15］。AMH和女性卵巢儲備功能關(guān)系密切，并具有一定的穩(wěn)定性，是目前被認為反映卵巢功能最佳的內(nèi)分泌學指標［16］。

本實驗中，發(fā)現(xiàn)灌胃4周后30%酒精組血FSH水平明顯高于其他三組，AMH、 INH-B明顯低于其他三組，這表明酒精攝入可影響垂體促性腺激素和血清性激素的水平，其影響程度與攝取酒精的濃度有相關(guān)性，短時間內(nèi)只有高濃度酒精出現(xiàn)該效應(yīng)，血液酒精濃度越高，血清FSH水平升高得越明顯，而AMH、INH-B降低的越明顯，這與隨璐［17］等人的研究結(jié)果基本上一致。灌胃8周時，10%和20%酒精組的血清FSH水平較灌胃4周時顯著升高，較對照組也明顯升高。這表明低濃度酒精短時間刺激對卵巢功能影響不大，只有長時間刺激才引起卵巢功能下降，從而導致FSH升高。20%酒精灌胃雌鼠4周，F(xiàn)SH與對照組比較無顯著差別，但AMH、INH-B卻降低，說明AMH、INH-B預測卵巢儲備功能比FSH更加敏感。

本實驗還發(fā)現(xiàn)灌胃4周后30%酒精組血E2水平明顯高于其他三組，但灌胃8周后10%和20%酒精組的E2水平和較4 周時顯著升高，且明顯高于同期30%酒精組和對照組，但30%酒精組灌胃8周后，E2明顯降低。這和王慶學研究的低濃度酒組使雌鼠E2升高，高濃度酒組使E2水平降低得研究結(jié)果基本一致［18］。E2是由卵巢合成和分泌的，E2水平越低，卵巢功能越差［5］。本研究還發(fā)現(xiàn)卵巢濕重的變化和E2水平基本保持一致，少量或短時間飲酒可能刺激卵巢，引起卵巢生長發(fā)育，從而導致卵巢質(zhì)量增加，而大劑量的酒精刺激可能對卵巢產(chǎn)生毒性，導致卵巢萎縮，卵巢質(zhì)量減輕，卵巢縮小，竇卵泡數(shù)目減少，因此E2水平降低。這和LINA［19］及王正朝［20］的研究結(jié)果基本一致。而林兵等人［21］研究發(fā)現(xiàn)只要連續(xù)飲酒4周就可以改變成年大鼠的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，并使大鼠體重下降，但研究未發(fā)現(xiàn)對卵巢質(zhì)量有影響，和我們的研究結(jié)果也基本基本一致。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，長時間、過量飲酒會對卵巢產(chǎn)生毒性，導致女性生殖內(nèi)分泌紊亂，加快卵巢的衰老，但其損傷機制有待進一步探索和研究。因此做好女性健康教育，崇尚健康生活方式，提醒婦女有節(jié)制飲酒，可以促進人類生殖健康。