朱暢，傅宇翔，夏利剛，李方，黃凱斌，孫逍

結(jié)直腸癌是全球最常見的癌癥之一，是全球癌癥死亡的第三大原因［1，2］。在中國結(jié)直腸癌發(fā)病率較高，男性中結(jié)直腸癌發(fā)病率僅次于肺癌、胃癌，而在女性中發(fā)病率也僅次于乳腺癌和肺癌［3］。結(jié)直腸癌是一種多因素疾病，飲食、年齡、飲酒、吸煙、體育活動(dòng)和體質(zhì)指數(shù)［1，2］等危險(xiǎn)因素均有可能誘使結(jié)直腸癌發(fā)生。研究表明，腸道微生物群的組成和功能在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)中發(fā)揮著重要作用［3-7］。由于腸道微生物群的復(fù)雜性［8-10］，以及個(gè)體和群體內(nèi)部之間的多樣性［11］，尋求識(shí)別與癌癥發(fā)病率相關(guān)的特定細(xì)菌特征的研究尚未取得成功［12］。然而，元基因組學(xué)研究表明，某些細(xì)菌種類的存在與結(jié)直腸癌有關(guān)［9］。研究證實(shí)，具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）在結(jié)直腸癌糞便和粘膜樣本中含量較高，增加了其在致癌過程中發(fā)揮致病作用的可能性［13-16］，但具體的作用機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探索具核梭桿菌的參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象選取來自深圳市人民醫(yī)院門診的腸鏡受檢者，結(jié)直腸癌和健康對(duì)照人群來自同一地區(qū)，飲食和生活方式相似，兩組受試者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）等無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有結(jié)直腸癌患者在采樣前1 個(gè)月均未用過微生態(tài)制劑和抗生素，健康對(duì)照人群采樣前無消化道疾病，也未使用過微生態(tài)制劑和抗生素。本研究分組情況為：15 例結(jié)直腸癌患者手術(shù)前為術(shù)前組，接受結(jié)直腸癌手術(shù)后3個(gè)月結(jié)腸鏡復(fù)查正常為術(shù)后組；15例無結(jié)直腸疾病的健康對(duì)照組。分別收集結(jié)直腸癌患者手術(shù)前3 天和術(shù)后3 個(gè)月、健康個(gè)體的糞便樣本用于具核梭桿菌豐度檢測(cè)。

1.2 材料

結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480 和具核梭桿菌ATCC25586 菌株購自美國ATCC，QIAmp DNA糞便試劑盒購自德國Qiagen 公司；SYBR GreenRe?altime PCR Master Mix 購自賽默飛公司；無菌糞便管購自德國Sarstedt 公司；轉(zhuǎn)錄組微陣列分析交由北京基石生命科技有限公司完成；引物序列由上海生工合成；all?in?one miRNA qRT?PCR檢測(cè)試劑盒購自GeneCopoeia 公司；CCK?8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購自美國Glpbio；TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司；pGL3?Basic 載體和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來自美國Promega公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco；LCN2 慢病毒載體構(gòu)建及包裝由北京海創(chuàng)科業(yè)生物科技有限公司完成；LCN2和actin一抗及對(duì)應(yīng)的含辣根過氧化物酶二抗購自CST 公司；ABI Step one Plus Real?time PCR 系統(tǒng)購自美國ABI 公司。

1.3 樣品儲(chǔ)存和具核梭桿菌DNA 分離

所有糞便樣本均收集于無菌糞便管中，在-80℃冷凍至DNA 提取。按照制造商說明書，采用Qiagen 提供的QIAmp DNA 糞便試劑盒從樣本中提取基因組DNA（gDNA），并保存在-80℃待用。

1.4 qPCR 檢測(cè)具核梭桿菌豐度

通過qPCR 檢測(cè)16SrRNA 基因來檢測(cè)具核梭桿菌相對(duì)豐度。取80 ng gDNA 模板、SYBR Green?Realtime PCR Master Mix，和終濃度為0.4 μM 的引物振蕩混勻，配成20 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR，擴(kuò)增采用ABI Step one Plus Real?time PCR 系統(tǒng)，反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min，然后95 ℃循環(huán)40 次，每次15 s，最后60 ℃反應(yīng)1 min。將prostaglandintrans?porter（PGT）基因用作內(nèi)參［17］，計(jì)算具核梭桿菌的相對(duì)豐度。

Fn（sense）：5′? CAACCATTACTTTAACTCTAC?CATGTTCA?3′，（antisense）：5′? GTTGACTTTACAG?AAGGAGATTATGTAAAAATC?3′；內(nèi)參PGT（sense）5′?ATCCCCAAAGCACCTGGTTT?3′，（antisense）：5′?AGAGGCCAAGATAGTCCTGGTAA?3′［18］。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)、Fn 感染與載體構(gòu)建

將結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116 和SW480 放至含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)于Fn 感染實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并與Fn 以感染復(fù)數(shù)MOI（1∶100）進(jìn)行孵育24 h，以不感染Fn 的結(jié)直腸癌細(xì)胞為Control 組，感染Fn 為Fn?infected 組。按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)說明，將含有LCN2 的慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116 和SW480，分為NC 組、OE?LCN2 組和OE?LCN2+Fn?infected 組。

1.6 qRT?PCR

用TRIzol 試劑分離提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green引物進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT?PCR），每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。Actin 作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。使用引物如下：LCN2（sense）：5′?AAGATACCTTAGTAGGTACTAACATT?3′；（antisense）：5?CCACGGATCTTACCCGGA? 3′。Actin（sense）：5′? TACGGAATGAACCTGACCATT ?3′；（antisense）：5′?GGACCATCATGCTAGCATCTGA?3′。

1.7 Western blotting

提取總蛋白，將熱變性的蛋白樣品點(diǎn)至10%SDS?PAGE 膠中，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。用TBST 配制的5%脫脂牛奶封閉，與一抗在4℃孵育過夜，再與二抗在室溫下孵育2 h。TBST 洗滌后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)熒光信號(hào)。

1.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以1.5×103/孔加入到96 孔板中，F(xiàn)n 轉(zhuǎn)染后，恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL，濃度為5 mg/mL 的CCK?8 溶液，繼續(xù)37℃恒溫培養(yǎng)4 h 后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)于Control 組的細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)。

1.9 Transwell 遷移侵襲實(shí)驗(yàn)

將Transwell 小室放入24 孔板中，上室加入200 μL 細(xì)胞濃度為1×103個(gè)/mL 的無血清單細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 含20%血清的培養(yǎng)基，放入5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，取出小室，用0.01%的DAPI 染色，倒置顯微鏡拍照。侵襲實(shí)驗(yàn)須將Matrigel 膠與4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按照1∶3 的比例稀釋混勻，然后將稀釋后的溶液加入到上室內(nèi)，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組獨(dú)立組均值間差異采用t檢驗(yàn)，多組均值間采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后具核梭桿菌豐度對(duì)比

定量PCR 檢測(cè)15 例術(shù)后3 個(gè)月結(jié)腸鏡復(fù)查正常的結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后，以及15 例正常健康個(gè)體的糞便樣品中的具核梭桿菌豐度，分析結(jié)果顯示這些結(jié)直腸癌患者術(shù)后具核梭桿菌豐度明顯降低，而術(shù)后組中具核梭桿菌豐度與健康組則無顯著差異。這些結(jié)果提示具核梭桿菌與結(jié)直腸癌存在可能的臨床相關(guān)性。

2.2 具核梭桿菌促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

將具核梭桿菌感染結(jié)直腸癌細(xì)胞，觀察具核梭桿菌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞感染具核梭桿菌后，細(xì)胞增殖活性升高，遷移和侵襲細(xì)胞能力增強(qiáng)，提示具核梭桿菌能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖1 結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后及正常健康個(gè)體中具核梭桿菌豐度對(duì)比

圖2 具核梭桿菌促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲 A：CCK?8 檢測(cè)具核梭桿菌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116 和SW480增殖活性的影響；B：Transwell 檢測(cè)具核梭桿菌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116 和SW480 遷移和侵襲的影響

2.3 具核梭桿菌抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中LCN2的表達(dá)

針對(duì)具核梭桿菌感染前后的HCT116 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組微陣列分析，結(jié)果顯示具核梭桿菌使結(jié)直腸癌細(xì)胞中多個(gè)基因發(fā)生了不同程度的差異表達(dá)，其中LCN2 是Fn 感染結(jié)直腸癌細(xì)胞后表達(dá)最具顯著差異的基因，其表達(dá)受到抑制（圖3A）。為了驗(yàn)證微陣列檢測(cè)結(jié)果，我們進(jìn)一步采用qPCR和Western blot 分析，結(jié)果顯示Fn 感染HCT116 和HT29 細(xì)胞后，LCN2 mRNA 水平和蛋白表達(dá)均下調(diào)（P＜0.01，圖3B，C）。

圖3 具核梭桿菌下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞LCN2 的表達(dá) A：微陣列分析具核梭桿菌影響結(jié)直腸癌細(xì)胞基因的差異表達(dá)；B：qPCR 檢測(cè)具核梭桿菌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中LCN2 相對(duì)mRNA 表達(dá)的影響；C：Western blot 檢測(cè)具核梭桿菌對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中LCN2 蛋白表達(dá)的影響；**P＜0.01

2.4 LCN2 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

LCN2 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)揮什么作用呢，我們?cè)诮Y(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)LCN2，并通過CCK?8 和Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了LCN2 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。圖4 結(jié)果顯示，過表達(dá)LCN2抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活性和遷移侵襲能力，但具核梭桿菌感染后卻能夠減弱LCN2 過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)，使得結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活性、和遷移侵襲能力一定程度上恢復(fù)。因此，以上結(jié)果提示具核梭桿菌可能通過降低LCN2 的表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。

圖4 LCN2 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 A：Western blot 檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中LCN2 的蛋白表達(dá)；B：CCK?8 檢測(cè)LCN2 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活性的影響；C：Transwell 檢測(cè)LCN2 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響；*P＜0.05，**P＜0.01

3 討 論

越來越多的研究表明腸道菌群與結(jié)直腸癌相關(guān)，參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。具核梭桿菌是一種革蘭氏陰性厭氧菌，研究顯示具核梭桿菌與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［16］，但具核梭桿菌參與結(jié)直腸癌的作用機(jī)制仍不清楚，因此，本研究旨在探究腸道細(xì)菌具核梭桿菌影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。在本研究中，我們比較了來自同一地區(qū)，背景相似的15 個(gè)術(shù)后恢復(fù)良好的結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后的糞便樣本和15 個(gè)健康受試者的糞便樣本，結(jié)果顯示，具核梭桿菌在術(shù)前組中豐度相對(duì)較高，而在術(shù)后組與健康組中豐度較低，說明具核梭桿菌與結(jié)直腸癌存在相關(guān)可能性。

為了驗(yàn)證具核梭桿菌與結(jié)直腸癌細(xì)胞的關(guān)系，本研究將具核梭桿菌感染結(jié)直腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。據(jù)報(bào)道，微生物群影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的一個(gè)潛在機(jī)制是通過影響細(xì)胞基因的表達(dá)［19，20］。因此，我們推測(cè)具核梭桿菌可能也是通過影響結(jié)直腸癌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)來參與結(jié)直腸癌的發(fā)展。通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌豐度與LCN2 表達(dá)負(fù)相關(guān)，通過進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌能夠抑制LCN2 mRNA 和蛋白表達(dá)，并通過下調(diào)LCN2 來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖活性以及遷移與侵襲能力。然而，具核梭桿菌調(diào)控LCN2 表達(dá)的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步去探究。

LCN2 是由腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌的胞內(nèi)可運(yùn)輸鐵離子的蛋白質(zhì)，通過調(diào)控鐵離子運(yùn)輸參與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。但據(jù)報(bào)道，LCN2 在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用有所不同，如敲除LCN2 后，高遷移侵襲前列腺癌細(xì)胞系PC3 增殖能力減弱［21］，而也有研究發(fā)現(xiàn)LCN2 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)［22，23］，LCN2 在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中的表達(dá)低于非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌［23］，本研究結(jié)果也顯示LCN2 能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Feng 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，LCN2 通過抑制NF?kβ/snail 信號(hào)通路，抑制上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此，LCN2 可作為結(jié)腸癌潛在的治療靶標(biāo)。

綜上，具核梭桿菌可以通過降低LCN2 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性發(fā)展，為L(zhǎng)CN2作為與具核梭桿菌相關(guān)的結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。