李斐， 常昆鵬， 張煒

鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院耳鼻咽喉科(河南洛陽 471003)

喉癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，具有病死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。喉癌的發(fā)病因素復(fù)雜，由多種內(nèi)、外源性致癌因素共同作用所致。研究表明，喉癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多基因參與的復(fù)雜過程[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度>200個核苷酸的非編碼RNA，能通過多種機(jī)制參與疾病或腫瘤的發(fā)生。生長組織特異性轉(zhuǎn)錄體5(growth attest-specific transcript 5，lncRNA GAS5)在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡等。研究顯示，lncRNA GAS5在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且低表達(dá)患者預(yù)后較差，發(fā)揮抑癌基因的作用[3]。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1)是一個高度保守的lncRNA，主要在核內(nèi)表達(dá)。lncRNA MALAT1在多種組織內(nèi)表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生理活動中起重要作用，且在細(xì)胞G1/S期及有絲分裂過程中起調(diào)控作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與患者預(yù)后有關(guān)[5]。lncRNA GAS5和lncRNA MALAT1在多種腫瘤疾病中發(fā)揮作用，但二者在喉癌中的表達(dá)及作用鮮少有報道。因此，本研究將通過檢測喉癌中l(wèi)ncRNA GAS5和lncRNA MALAT1的表達(dá)情況，分析二者的表達(dá)與喉癌患者預(yù)后的關(guān)系，為喉癌的診斷及治療提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年11月至2014年2月在本院進(jìn)行手術(shù)切除的63例喉癌患者作為研究對象，其中男49例，女14例；年齡39～74歲，平均(56.24±7.85)歲。將切除的癌組織作為觀察組，同時取同一患者的癌旁(距腫瘤邊緣>2 cm)組織作為對照組(鏡檢未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞)。按照喉癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[6]：其中Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期35例。按照病理學(xué)分級：其中低分化29例，中高分化34例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初發(fā)喉癌患者；(2)術(shù)前未進(jìn)行放療或化療者；(3)臨床病理資料完整者；(4)患者及家屬知情且同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)合并患有肝、腎、心臟等疾病者；(3)自身免疫疾病者。

收集患者的臨床資料并進(jìn)行為期5年的隨訪，隨訪的開始日期為手術(shù)日期，截止日期到2019年3月1日。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號：12183025)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：KR116)，均購自于北京天根生化有限公司；qRT-PCR試劑盒(貨號：204141)，購自德國QIAGEN公司；實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：LightCyler 480)，購自德國Roche公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 收集手術(shù)切除的喉癌組織，同時采集距腫瘤邊緣2 cm以外的癌旁組織，將樣本置于-80℃冰箱備用。

1.3.2 qRT-PCR測定lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表達(dá)量 從-80℃取出樣本，提取總RNA：將樣本超聲勻漿，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說明書操作，檢測RNA純度及其完整度；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將所得RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。qRT-PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系20 μL，10 μL 2×SYBR Mix，cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，H2O 6 μL，每個樣本做3次平行，反應(yīng)條件為95℃反應(yīng)30 s；95℃反應(yīng)15 s、60℃反應(yīng)30 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min，在qPCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。lncRNA GAS5的上游引物為：5′-CTTCTGGGCTCAACTGATCCT-3′，下游引物為：5′-TTGTGCCATGAGACTCCATCAG-3′；lncRNA MALAT1的上游引物為：5′-GGATCGTCTCCCCACAAGCC-3′，下游引物為：5′-GGTCTGTGCCTCGATCAAAAGGCA-3′；二者均以GAPDH為內(nèi)參，上游引物為：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，下游引物為：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。使用ΔΔCt 法對結(jié)果進(jìn)行相對定量分析，根據(jù)各樣本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA GAS5和lncRNA MALAT1的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 測定組織中l(wèi)ncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表達(dá)量 觀察組lncRNA GAS5的表達(dá)量明顯低于對照組(P<0.05)，lncRNA MALAT1的表達(dá)量則明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組 lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表達(dá)情況比較

2.2 喉癌患者lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)觀察組lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1表達(dá)水平的中位值分別將其分為兩組，其中l(wèi)ncRNA GAS5高表達(dá)26例，低表達(dá)37例；lncRNA MALAT1高表達(dá)35例，低表達(dá)28例。喉癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表達(dá)水平與年齡、腫瘤部位及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)；lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表達(dá)水平與TNM分期、腫瘤的分化程度有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 喉癌患者lncRNA H19、SIRT6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 影響喉癌患者預(yù)后的因素分析 單因素分析顯示，lncRNA MALAT1表達(dá)、TNM分期及腫瘤分化程度均是影響喉癌患者預(yù)后的危險因素，lncRNA GAS5表達(dá)是影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。多因素分析顯示，lncRNA MALAT1表達(dá)是影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(HR=1.90，95%CI為1.27～2.84，P<0.05)，lncRNA GAS5表達(dá)是影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(HR=0.79，95%CI為0.65～0.97，P<0.05)。見表3。

表3 影響喉癌患者預(yù)后的因素分析

2.4 喉癌組織lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 分別繪制喉癌患者術(shù)后1～60個月lncRNA GAS5高、低表達(dá)者及l(fā)ncRNA MALAT1高、低表達(dá)者的生存曲線。lncRNA GAS5高表達(dá)者及低表達(dá)者術(shù)后5年的總生存率分別為76.92%(20/26)、51.35%(19/37)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。lncRNA MALAT1高表達(dá)者及低表達(dá)者術(shù)后5年的總生存率分別為51.43%(18/35)、75.00%(21/28)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 喉癌患者癌組織lncRNA GAS5表達(dá)5年生存曲線

圖2 喉癌患者癌組織lncRNA MALAT1表達(dá)5年生存曲線

3 討論

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，侵襲度相對較高，其主要的發(fā)病因素包括不良生活習(xí)慣、外界環(huán)境和遺傳因素等。近年來，隨著環(huán)境污染加劇、人口老齡化和吸煙率居高不下，喉癌發(fā)病率呈上升趨勢，且預(yù)后狀況不容樂觀[7]。目前，對于早期喉癌的治療可以通過手術(shù)及放療輔助達(dá)到預(yù)期；但喉癌具有隱蔽性，發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，治療效果不佳，術(shù)后患者的生活將受到極大的影響。因此，在分子水平上尋求高效的診斷及治療標(biāo)志物，對喉癌患者的生存質(zhì)量有重大意義。

LncRNA大多具有高度保守的二級、三級結(jié)構(gòu)，能夠在生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。大量研究表明，lncRNA能夠在染色體劑量補(bǔ)償、基因組印記、功能性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等過程中發(fā)揮重要作用[8]。盡管lncRNA不能編碼蛋白，但參與機(jī)體的生理活動，如細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄前與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳學(xué)修飾及免疫應(yīng)答等，且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19在喉癌組織中表達(dá)下調(diào)，可能具有抑癌作用[9]；lncRNA HOTAIR在喉癌患者中表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)越高，患者生存率越低，可能具有致癌作用[10]。

lncRNA GAS5最初在鼠NIH3T3纖維原細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，在人體內(nèi)位于1q25.1處，含12個外顯子，其在組織中廣泛表達(dá)，但表達(dá)水平差異較大。研究顯示，lncRNA GAS5在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌作用；過表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5在乳腺癌組織中低表達(dá)，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞株中過表達(dá)后可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Shi等[13]研究表明，lncRNA GAS5在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)，腫瘤越大、TNM分期越高，其表達(dá)水平越低。本研究檢測喉癌組織中l(wèi)ncRNA GAS5的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)觀察組lncRNA GAS5的表達(dá)顯著低于對照組，提示lncRNA GAS5可能參與喉癌的發(fā)生發(fā)展；喉癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA GAS5的表達(dá)與TNM分期、腫瘤的分化程度有關(guān)；分析影響喉癌患者的預(yù)后因素，發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5表達(dá)是影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，提示上調(diào)lncRNA GAS5的表達(dá)可能會抑制喉癌的發(fā)展進(jìn)程；喉癌患者術(shù)后5年的生存狀況分析表明，lncRNA GAS5高表達(dá)患者的總生存率明顯高于低表達(dá)患者，提示lncRNA GAS5低表達(dá)對喉癌患者的預(yù)后起不良效果。

lncRNA MALAT1最初在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移過程中被發(fā)現(xiàn)，位于人染色體11q13.1處，來自單個外顯子。lncRNA MALAT1可影響多種蛋白質(zhì)在核內(nèi)的定位，并參與染色體重排、組蛋白修飾、小RNA構(gòu)建等過程，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15]。李子博等[16]研究表明，lncRNA MALAT1在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，在乳腺癌中具有一定的診斷價值。孫敏等[17]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，lncRNA MALAT1表達(dá)與宮頸癌患者的預(yù)后有關(guān)，高表達(dá)患者的術(shù)后生存率低于低表達(dá)患者。本研究檢測喉癌組織中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)觀察組lncRNA MALAT1的表達(dá)顯著高于對照組，提示lncRNA MALAT1可能參與喉癌的發(fā)生發(fā)展；喉癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達(dá)與TNM分期、腫瘤的分化程度有關(guān)；分析影響喉癌患者的預(yù)后因素，發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1表達(dá)是影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，提示下調(diào)lncRNA MALAT1的表達(dá)可能會抑制喉癌的發(fā)展進(jìn)程；喉癌患者術(shù)后5年的生存狀況分析表明，lncRNA MALAT1高表達(dá)患者的總生存率明顯低于低表達(dá)患者，提示lncRNA MALAT1高表達(dá)對喉癌患者的預(yù)后起不良效果。

綜上所述，在喉癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA GAS5表達(dá)下調(diào)，lncRNA MALAT1表達(dá)上調(diào)，二者均與TNM分期、腫瘤的分化程度有關(guān)，與喉癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，提示二者可作為預(yù)測喉癌預(yù)后的特異指標(biāo)，為喉癌的預(yù)后治療起到幫助。但本研究未對lncRNA GAS5、lncRNA MALAT1在喉癌中的作用機(jī)制進(jìn)行探討，下一步將會著重探索二者在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，以期為喉癌的診斷及治療提供依據(jù)。