李 泉，聶 珂△，喬正榮，代 濤，吳小蘭，李勇樸，柏 艷，左福林，周麗莉，朱小嵐,彭孝斌

(重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院：1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；2.感染科；3.呼吸重癥科；4.放射科，重慶 401220；5.重慶市長壽區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，重慶 401220)

2019年12月，湖北省武漢市出現(xiàn)多起不明原因肺炎病例。目前，該肺炎被證實(shí)為一種新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染所致，且這種病毒存在人傳人現(xiàn)象[1-2]。該病毒屬于冠狀病毒科β屬，直徑60～140 nm，具有多形性，外有包膜，內(nèi)含圓形或橢圓形顆粒，國際病毒分類學(xué)委員會將其命名為SARS-CoV-2[3]。國家衛(wèi)生健康委員會目前已將SARS-CoV-2感染所致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)納入乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施進(jìn)行管理[4]。COVID-19的主要臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、乏力、干咳等呼吸道感染癥狀為主，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等，但有部分患者表現(xiàn)為隱匿發(fā)病，無明顯癥狀。重癥COVID-19患者在發(fā)病1周后可出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥，并快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出、凝血功能障礙，最終導(dǎo)致患者死亡[5-6]。目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測SARS-CoV-2核酸陽性是COVID-19診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[4]?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝自\療方案(試行第五版)》[4]將發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)正常或降低、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少定為COVID-19的臨床表現(xiàn)之一，但目前關(guān)于COVID-19患者淋巴細(xì)胞亞群檢測的相關(guān)研究較少。本研究探討了外周血淋巴細(xì)胞亞群在COVID-19患者中的表達(dá)水平及臨床意義，以期為COVID-19的早期診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月18日至2月25于重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院住院治療的25例SARS-CoV-2核酸檢測陽性的患者為研究對象。其中21例確診為COVID-19，有發(fā)熱、咳嗽、乏力等臨床癥狀，SARS-CoV-2核酸檢測陽性的患者納入COVID-19組；4例無臨床癥狀，但SARS-CoV-2核酸檢測為陽性的患者納入無癥狀感染組。COVID-19組男10例，女11例；年齡為12～76歲，平均(51.84±6.24)歲。無癥狀感染組男2例，女2例；年齡為50～57歲，平均(53.00±0.51)歲。選取同期體檢的20例健康者為對照組,其中男9例，女11例；年齡為15～66歲，平均(43.05±5.48)歲。COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)[4-5]：符合流行病學(xué)相關(guān)特征、符合疾病相關(guān)臨床表現(xiàn)，且咽拭子/痰液/纖維支氣管鏡灌洗液檢測SARS-CoV-2核酸為陽性。3組研究對象年齡、性別等基本資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 流式細(xì)胞儀(型號BriCyte E6)、CD3/CD16+56/CD45/CD19 檢測試劑(流式細(xì)胞法-FITC/PE/PerCP/APC)和CD3/CD8/CD45/CD4 檢測試劑(流式細(xì)胞法-FITC/PE/PerCP/APC)均由深圳邁瑞科技有限公司提供。

1.3檢測方法 研究對象均采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2) 抗凝靜脈血2 mL作為待測標(biāo)本。取試管2支，1支試管中加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4 試劑，標(biāo)記為“T”，另1 支試管中加入20 μL CD3/CD16+56/CD45/CD19 試劑，標(biāo)記為“BNK”；然后分別向2 支試管中加入待測標(biāo)本50 μL，混勻，室溫避光孵育15 min；再分別向2 支試管中加入450 μL 1×溶血素，混勻，室溫避光孵育5～10 min，上機(jī)檢測?？偭馨图?xì)胞計(jì)數(shù)參考區(qū)間：≥1 530/μL；自然殺傷細(xì)胞計(jì)數(shù)(NK#)參考區(qū)間：≥84/μL。

1.4觀察指標(biāo) 分析COVID-19 組與無癥狀感染組患者總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(Lym#)及NK#水平；比較3組淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果，包括T淋巴細(xì)胞百分比(T%)、B淋巴細(xì)胞百分比(B%)、NK細(xì)胞百分比(NK%)、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比(CD4+T%)、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比(CD8+T%)、Lym#、T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(T#)、B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(B#)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(CD4+T#)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(CD8+T#)、NK#、CD4+T#與CD8+T#比值(CD4+T/CD8+T)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 6.0繪圖。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1COVID-19組患者Lym#及NK#水平 21例COVID-19患者中，18例(85.71%)患者的Lym#水平低于參考區(qū)間下限，3例(14.29%)患者的Lym#水平在正常參考區(qū)間內(nèi)，見圖1。20例(95.24%)患者的NK#水平低于參考區(qū)間下限，且19例患者的NK#水平均低于50/μL，嚴(yán)重者僅為4/μL；僅1例患者的NK#水平在正常參考區(qū)間內(nèi)，見圖2。

注：#1～#21分別代表21例確診為COVID-19且有臨床癥狀患者。

注：#1～#21分別代表21例確診為COVID-19且有臨床癥狀患者。

2.2無癥狀感染組患者Lym#及NK#水平 在4例無癥狀感染患者中，僅有1例患者的Lym#水平為1 353/μL，略低于參考區(qū)間下限，其他患者的Lym#、NK#水平均在參考區(qū)間內(nèi)。見圖3～4。

2.33組淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較 3組間T%、B%、NK%、Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#、NK#水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。COVID-19組T%、B%水平高于對照組，NK%、Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#、NK#水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。COVID-19組NK#及NK%水平低于無癥狀感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

注：#22～#25分別代表4例核酸檢測陽性但無臨床癥狀的患者。

注：#22～#25分別代表4例核酸檢測陽性但無臨床癥狀的患者。

表1 3組淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果分析[ M(P25，P75)]

3 討 論

淋巴細(xì)胞是人體的免疫細(xì)胞，在不同部位分化成熟，可分為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是在適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞，是免疫系統(tǒng)的核心成分，使免疫系統(tǒng)具備識別和記憶抗原等能力，從而清除入侵機(jī)體的細(xì)菌、病毒等。

本文通過對21例COVID-19患者與20例健康體檢者的淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，85.71%的COVID-19患者表現(xiàn)為Lym#減少，95.24%的COVID-19患者表現(xiàn)為NK細(xì)胞減少，且與對照組比較，Lym#、T#、CD4+T#、CD8+T#水平均降低(P<0.05)。SARS-CoV-2可侵襲患者的淋巴結(jié)和脾等免疫器官，不斷增殖，從而感染更多的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，致其調(diào)亡，因此COVID-19患者表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞減少。但有研究發(fā)現(xiàn)，在SARS-CoV-2感染后，短時(shí)間內(nèi)機(jī)體為了對抗SARS-CoV-2感染，會產(chǎn)生特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，所以COVID-19患者感染早期可表現(xiàn)為T%和B%高于對照組[7]。

NK細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，無需抗原預(yù)先致敏就能殺傷靶細(xì)胞，其殺傷作用早于T淋巴細(xì)胞，因此在病毒感染后的早期免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。然而，為了適應(yīng)NK細(xì)胞的選擇壓力，許多病毒已經(jīng)具備了逃逸宿主NK細(xì)胞免疫反應(yīng)的策略，大致包括上調(diào)NK細(xì)胞抑制信號[8]、下調(diào)NK細(xì)胞激活信號[9]、黏附分子[10]及分子模擬策略[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，COVID-19組患者NK%，NK#顯著降低(P<0.05)。COVID-19患者NK細(xì)胞減少的原因可能與以下相關(guān)：(1)患者本身免疫功能存在缺陷，NK細(xì)胞數(shù)量較少；(2)NK細(xì)胞在對抗SARS-CoV-2時(shí)發(fā)生自身消耗，機(jī)體的造血系統(tǒng)未能及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充；(3)SARS-CoV-2感染機(jī)體后，侵犯機(jī)體免疫系統(tǒng)，病變累及淋巴結(jié)、扁桃體、脾和骨髓，出現(xiàn)多器官功能障礙，破壞NK細(xì)胞或抑制NK細(xì)胞的生成[9-10]。以上3點(diǎn)單獨(dú)或同時(shí)存在都可能造成人體在感染初期無法通過NK細(xì)胞來及時(shí)清除被病毒感染的細(xì)胞，最終導(dǎo)致COVID-19的發(fā)生。本研究4例無癥狀感染患者中，僅有1例患者的總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)為1 353/μL，略低于正常參考值，其他患者的Lym#、NK#均在正常參考區(qū)間內(nèi)?？赡苁怯捎赟ARS-CoV-2感染后，無癥狀感染者自身免疫功能強(qiáng)，產(chǎn)生大量NK細(xì)胞殺傷病毒，保護(hù)機(jī)體各器官不受損傷，所以未表現(xiàn)出臨床癥狀[11]。此外，本研究觀察到部分治療恢復(fù)期的COVID-19患者臨床癥狀與NK#有關(guān)，NK#恢復(fù)正常的患者其臨床癥狀恢復(fù)時(shí)間短于NK#異常者,但由于病例數(shù)較少，未進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，后續(xù)將進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

COVID-19患者存在淋巴細(xì)胞亞群水平的異常，其中NK細(xì)胞下降明顯；COVID-19患者、無癥狀感染者與健康者淋巴細(xì)胞亞群水平存在差異，提示淋巴細(xì)胞亞群在COVID-19的診斷、病情評估中可能具有一定的臨床價(jià)值；此外，通過淋巴細(xì)胞亞群檢測還能了解患者的機(jī)體免疫情況，有利于判斷預(yù)后。