吳鵬波,吳曉曼,俞媛潔,郭一天,李 明,譚詩云

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430060)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)疾病，目前尚無安全有效的治療手段[1]。既往研究一致表明NAFLD患者肝細(xì)胞過度凋亡，但細(xì)胞凋亡的調(diào)控機制仍不明了[2-3]。多種病理生理過程參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種疾病細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。部分研究報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過影響線粒體參與NAFLD發(fā)病[6-7]，本研究著重探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對NAFLD細(xì)胞模型凋亡特別是線粒體途徑凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料 HepG2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 正置熒光顯微鏡購于日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購于Beckman公司；Western Blot電轉(zhuǎn)儀購于Invitrogen。

1.2.2主要試劑 油酸、4-苯基丁酸(4-PBA)購于Sigma公司；BODIPY 493/503熒光染料購于Invitrogen公司；Hoechst 33258染料、Annexin V-FITC/PI雙染料、熒光探針JC-1均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)及線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2) 、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的以及細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C(CytC)抗體購于Sigma公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至對數(shù)生長期。油酸誘導(dǎo)構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型進(jìn)行造模[4]。實驗細(xì)胞分為4組：對照組、造模12 h組、造模16 h組、4-PBA組(細(xì)胞接種過夜后加入油酸和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA培養(yǎng)16 h，其中4-PBA工作濃度為1 mmol/L)。

1.3.2BODIPY 493/503染色 細(xì)胞分組處理后磷酸鹽緩沖溶液(PBS)充分洗滌，甲醛固定后PBS再次充分洗滌，再加入適量的BODIPY 493/503熒光染料，工作濃度為0.1 mg/L，充分搖勻后常溫下染色6 min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中的熒光強度。

1.3.3Hoechst 33258染色 細(xì)胞分組處理后PBS充分洗滌，甲醛固定后PBS再次充分洗滌，再加入適量的Hoechst 33258染料，室溫下充分搖勻避光染色5 min，吸干含有染料的培養(yǎng)液后充分洗滌細(xì)胞，晾干后在352 nm的激發(fā)波長下熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞中的熒光強度。Hoechst 33258染料可穿透細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光即判定細(xì)胞凋亡。

1.3.4Annexin V-FITC/PI雙染色 細(xì)胞分組處理后充分洗滌，用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，離心洗滌懸浮細(xì)胞經(jīng)過過濾再次離心后加入Annexin V-FITC和PI染液，常溫下避光孵育20 min，加入緩沖液懸浮細(xì)胞，上機檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.3.5JC-1法檢測線粒體膜電位(MMP) 細(xì)胞分組處理后充分洗滌，制成懸浮液后加入熒光探針JC-1，工作濃度為5 μmol/L，常溫下孵育15 min后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞紅、綠色熒光強度。以紅色與綠色熒光強度的比值來衡量線粒體去極化程度，比值越高提示線粒體膜電位越高。

1.3.6免疫蛋白印跡(Western blot)檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)過消化離心裂解后采用水煮法制作蛋白樣品，蛋白樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠中分離，將分離膠中蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，根據(jù)各個目標(biāo)蛋白分子量參照內(nèi)參切膜，經(jīng)過洗滌、封閉后加入GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2、Caspse-3以及細(xì)胞質(zhì)CytC抗體孵育12 h，次日清晨充分洗滌加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗后孵育2 h，經(jīng)過顯影定影根據(jù)灰度判定各蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞脂肪變性情況 采用BODIPY 493/503染色，可見對照組細(xì)胞內(nèi)較為稀少的綠色熒光，造模12 h及16 h后HepG2細(xì)胞綠色熒光呈時間依賴性增加；4-PBA組HepG2細(xì)胞內(nèi)綠色熒光相比造模16 h組顯著減少。見圖1。

2.2Hoechst 33258染色 對照組中較少細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，造模12 h和16 h后細(xì)胞凋亡呈時間依賴性增加，相比造模16 h組，加用4-PBA后細(xì)胞凋亡明顯減少，見圖2。

注:A為對照組；B為造模12 h組；C為造模16 h組；D為4-PBA組。

注:A為對照組；B為造模12 h組；C為造模16 h組；D為4-PBA組。

2.3Annexin V-FITC/PI檢測凋亡情況 對照組細(xì)胞較少出現(xiàn)凋亡[(1.31±0.12)%]，造模12 h和16 h后細(xì)胞凋亡率明顯上升[(1.91±0.13)%、(5.11±0.16)%]，相比造模16 h組，加用4-PBA組細(xì)胞凋亡率下降[(2.87±0.15)%]。見圖3。

注:A為對照組；B為造模12 h組；C為造模16 h組；D為4-PBA組。

2.4MMP變化 與對照組比較，經(jīng)造模后HepG2細(xì)胞MMP逐步降低，以造模16 h組最為明顯，相比造模16 h組加用4-PBA后細(xì)胞MMP升高。見圖4。

注:A為對照組；B為造模12 h組；C為造模16 h組；D為4-PBA組。

2.5內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 造模2 h組和造模6 h組細(xì)胞Bax、Caspse-3、GRP78、CHOP、胞質(zhì)CytC蛋白表達(dá)增加，而Bcl-2表達(dá)降低；4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后細(xì)胞GRP78、CHOP、Bax、Caspse-3、胞質(zhì)CytC蛋白表達(dá)降低，而Bcl-2蛋白表達(dá)增加。見圖5。

注:A為對照組；B為造模12 h組；C為造模16 h組；D為4-PBA組。

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，它參與蛋白加工、鈣離子儲存、脂代謝和細(xì)胞解毒，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有至關(guān)重要的作用[8]。肝細(xì)胞中存在較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)肝細(xì)胞長期受到油酸等有害刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會出現(xiàn)功能紊亂即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[8]。國內(nèi)外學(xué)者對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在NAFLD中的作用進(jìn)行研究，多數(shù)結(jié)果認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對NAFLD具有促進(jìn)其發(fā)病的作用[9]，本研究通過染色發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后肝細(xì)胞脂肪沉積明顯緩解，結(jié)果與既往研究結(jié)論一致。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在受到內(nèi)源性或者外源性信號刺激下為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而啟動的多種信號通路和基因調(diào)控的生理性死亡[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)凋亡在NAFLD發(fā)生及發(fā)展過程中具有重要的作用[10]。凋亡啟動途徑有線粒體途徑、死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[11]。本研究著重研究的是線粒體途徑凋亡。生理狀態(tài)下， Bcl-2和Bax蛋白通過保持線粒體膜的完整性維持正常的線粒體功能[12-13]。病理生理狀態(tài)下線粒體出現(xiàn)膜通透性改變，隨之出現(xiàn)MMP改變，CytC被釋放至胞質(zhì)中[10-11]。因此，Bcl-2和Bax是線粒體途徑凋亡關(guān)鍵的啟動因子，膜電位改變是線粒體途徑凋亡的特征性改變，CytC釋放至細(xì)胞質(zhì)是線粒體途徑凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究JC-1法檢測結(jié)果顯示造模后細(xì)胞MMP下降，Western blot結(jié)果顯示Bax、Caspse-3、胞質(zhì)CytC蛋白表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低提示線粒體途徑凋亡可能參與NAFLD的發(fā)生及發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡率均升高。為探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對細(xì)胞的影響，4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后細(xì)胞膜電位下降,Caspse-3、細(xì)胞質(zhì)CytC蛋白表達(dá)降低，而Bcl-2蛋白表達(dá)增加，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對NAFLD細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。既往有學(xué)者針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡在NAFLD中的關(guān)系進(jìn)行了研究，認(rèn)為改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以抑制細(xì)胞凋亡[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞內(nèi)異常的鈣離子水平促使線粒體鈣離子超載的發(fā)生，線粒體內(nèi)鈣離子的大量增加會打開膜滲透轉(zhuǎn)換孔，膜滲透轉(zhuǎn)換孔開放后引起線粒體膜變化，誘發(fā)CytC釋放啟動線粒體途徑凋亡[15-16]。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后可降低線粒體途徑凋亡率，結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對NAFLD的發(fā)病有影響。但細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過何種分子機制誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體途徑凋亡仍有待進(jìn)一步探討。