江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，徐州221007

利培酮（Risperidone）為苯異惡唑衍生物，具有較強(qiáng)的中樞5-HT,尤其是5-HT2A 和D2 受體的拮抗作用，臨床主要用于治療急性和慢性精神分裂癥，以及其它各種精神病性狀態(tài)的明顯的陽性癥狀和陰性癥狀[1]。帕利哌酮（Pallipiperidone）是利培酮在體內(nèi)經(jīng)CYP2D6 和CYP3A 酶轉(zhuǎn)化生成的代謝物[2]，藥理活性是利培酮的70%[3]，是利培酮片的臨床活性成分之一。本試驗(yàn)建立了靈敏可靠的LC-MS/MS 方法檢測(cè)血漿中利培酮和帕利哌酮的濃度，計(jì)算空腹和餐后狀態(tài)下兩者的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以評(píng)估2 種利培酮片的生物等效性。

1 資料與方法

1.1 藥品與儀器

藥品：受試制劑（T）：利培酮片，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，1 mg，含量98.8%，批號(hào)：S20 170604；參比制劑（R）：利培酮片，美國楊森制藥有限公司，1 mg，含量95.6%，批號(hào)：16DG442X；乙腈為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

儀器：高效液相色譜儀，島津公司；質(zhì)譜：Applied Biosystems/Sciex；數(shù)據(jù)采集：Analyst 1.6.2，Analyst 1.6.3，AppliedBiosystems/Sciex；數(shù)據(jù)處理：Watson LIMS 7.5 SP1，Microsoft Office 2007 或其他版本；MSA6.6s-000-DM 百萬分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 受試者選擇

本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者均簽署知情同意書。

空腹和餐后試驗(yàn)各48 名健康受試者，年齡18～42 歲；體重指數(shù)在19～26 kg·m-2；無異常的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)查，無顯著的臨床癥狀；無不良嗜好；試驗(yàn)前兩周內(nèi)未使用任何藥物；本試驗(yàn)服藥前一個(gè)月內(nèi)未參加過任何藥物臨床試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 隨機(jī)分組方法 空腹及餐后研究均采用單劑量、開放、隨機(jī)、兩周期、兩序列自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)?？崭辜安秃笱芯扛饔?jì)劃入組48 例受試者，兩部分篩選及隨機(jī)分組方法一致，各部分均分兩批進(jìn)行篩選和試驗(yàn)，每批計(jì)劃入組24 名受試者。

第一批篩選合格的24 名受試者編號(hào)為001～024，若多于24 例，則作為備選者；第二批篩選合格的24 名受試者編號(hào)為025～048，若多于24 例，則作為備選者。每批分別采用區(qū)組隨機(jī)化方法產(chǎn)生的隨機(jī)表，將受試者隨機(jī)分為I 組和Ⅱ組。I 組受試者第一周期服用受試制劑（T），第二周期服用參比制劑（R）；Ⅱ組受試者第一周期服用R，第二周期服用T。

1.3.2 給藥及采血 給藥當(dāng)天早晨已于隔夜空腹至少10 h。餐后組進(jìn)食高脂高熱早餐，并在30 min內(nèi)用餐完畢。于進(jìn)餐后30 min 時(shí)服藥。第一周期I組空腹服用受試制劑1 mg，Ⅱ組空腹服用參比制劑1 mg；均約240 mL 溫開水送服。受試者服藥后保持半臥位約4 h。

在給藥前（服藥前60 min 內(nèi)視為0 h）和服藥后10、20、30、45 min，1.00、1.33、1.67、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00、14.00、24.00、36.00、8.00、72.00、96.00h 采集靜脈血，每次取血約4mL 至EDTA-2K 抗凝采血管中，搖勻，于采樣后1 h 內(nèi)置2～8 ℃2000×g 離心10 min，分離血漿，低溫保存待測(cè)。

經(jīng)約2 周的清洗期進(jìn)行第二周期試驗(yàn)。除藥物交叉外，其余試驗(yàn)步驟同第一周期。

1.3.3 分析檢測(cè) 血漿樣本處理：精密取待測(cè)血漿50.0 μL 加入50.0 μL 的內(nèi)標(biāo)工作溶液（5.00 ng·mL-1/5.00 ng·mL-1，利培酮-d4/帕利哌酮-d4溶液），振搖1 min，加入200 μL 的乙腈，劇烈振搖約10 min，室溫條件下以4000 r·min-1離心10 min，取100 μL 上清液，用200 μL 超純水稀釋，充分振搖10 min 進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

色譜條件：Waters 色譜柱Atlantis T3（2.1×50mm，5 μm）；流動(dòng)相A 含0.1%甲醛（FA）和5.00 mmol·L-1NH4Ac 的水溶液，流動(dòng)相B 含0.1%FA 的乙腈（流動(dòng)相梯度洗脫程序：0.00～3.00 min，A∶B=78%∶22.0%，3.10～3.60 min，A∶B=10%∶90.0%；3.70～5.00 min，A∶B=78%∶22.0%）；流速：0.400 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積5.00 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化，正離子模式，MRM，噴口電壓4000 V，氣簾氣壓力（CUR）241 kPa，霧化氣壓力（GS1）345 kPa，輔助氣壓力（GS2）345 kPa，離子源溫度（TEM）550 ℃，碰撞氣體CAD 9Unit。監(jiān)測(cè)的反應(yīng)離子對(duì)： 利培酮 ［MH］+m/z 411.2 →m/z 191.1，帕利哌酮［MH］+m/z 427.0→m/z 207.0；內(nèi)標(biāo)利培酮-d4［MH］+m/z 415.2→m/z 195.1；帕利哌酮-d4［MH］+m/z 431.2→m/z 211.1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用WinNonlin 6.4 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Cmax、Tmax均為實(shí)測(cè)值，AUC 用梯形法計(jì)算。采用BES，將Cmax、AUC0-t和AUC0-∞經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析（ANOVA），分析給藥序列間、制劑間、周期間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用BES，將Cmax、AUC0-t及AUC0-∞在進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行雙向單側(cè)t 檢驗(yàn)，進(jìn)行等效性評(píng)價(jià)。計(jì)算主要指標(biāo)的幾何均值比率（受試制劑/參比制劑）的90%置信區(qū)間，如在等效區(qū)間（80.00%～125.00%），判斷為生物等效。同時(shí)計(jì)算參數(shù)的個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)和把握度。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

本試驗(yàn)建立了檢測(cè)血漿中利培酮和帕利哌酮濃度的LC-MS/MS 法并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。利培酮的線性范圍為0.050 0～30.0 ng·mL-1，帕利哌酮0.050 0～15.0 ng·mL-1；利培酮的批內(nèi)和批間精密度分別為8.6%和7.8%，準(zhǔn)確度分別為-11.3%～4.2%和-4.0%～1.0%；帕利哌酮批內(nèi)和批間精密度分別為6.6%和6.7%，準(zhǔn)確度分別為-8.7%～7.6%和-2.7%～3.2%。利培酮和帕利哌酮及其內(nèi)標(biāo)的提取回收率均＞90.6%，精密度均＜3.0%。利培酮和帕利哌酮出峰位置干擾峰的平均響應(yīng)值均不超過定量下限（LLOQ）標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品平均響應(yīng)值的10.3%，內(nèi)標(biāo)均不超出LLOQ標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品平均響應(yīng)值的0.1%，且利培酮與利培酮-d4，帕利哌酮與帕利哌酮-d4之間互相無干擾。利培酮和帕利哌酮的基質(zhì)效應(yīng)，包括溶血和高脂基質(zhì)效應(yīng)精密度均＜5.4%，準(zhǔn)確度均在86.3%～101.1%。利培酮和帕利哌酮樣品離心分離前基質(zhì)中待測(cè)物冰浴2.0 h 穩(wěn)定，生物樣品前處理過程中室溫15.8 h穩(wěn)定，制備后樣品8 ℃處理后樣品再進(jìn)樣5 天20 小時(shí)穩(wěn)定，-20 ℃/-70 ℃5 個(gè)凍融循環(huán)穩(wěn)定，生物基質(zhì)中-20 ℃61 天穩(wěn)定，-70 ℃61 天穩(wěn)定。以上表明，本試驗(yàn)建立的LC-MS/MS 分析方法靈敏、可靠，可用于血漿中利培酮和帕利哌酮的濃度檢測(cè)。

2.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

健康受試者在空腹和餐后狀態(tài)下口服受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖見圖1和圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1 和表2。

圖1 空腹?fàn)顟B(tài)下利培酮和帕利哌酮的平均血藥濃度-時(shí)間圖

2.3 生物等效性

圖2 餐后狀態(tài)下利培酮和帕利哌酮的平均血藥濃度-時(shí)間圖

表1 空腹?fàn)顟B(tài)下利培酮和帕利哌酮的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

設(shè)定利培酮片在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax的個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)為28%，AUC 的個(gè)體內(nèi)變異為30%。在顯著性水平α=0.05、把握度（1-β）為80%下，以Cmax的個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)估算的最低所需受試者為40例，考慮到臨床試驗(yàn)可能有一定的脫落，本試驗(yàn)正式試驗(yàn)計(jì)劃入組48 名受試者。

表2 餐后狀態(tài)下利培酮和帕利哌酮的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

空腹試驗(yàn)45 例志愿者完成了兩周期試驗(yàn)，納入BE 集。脫落3 例：2 例第一周期服藥后，分別因擔(dān)心健康問題和嚴(yán)重不良事件中止試驗(yàn)；第3 例因工作調(diào)動(dòng)在第二周期開始前退出試驗(yàn)。納入BE 集的45 例受試者的利培酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。45 例受試者帕利哌酮Cmax和AUC0-t在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；44 例受試者帕利哌酮AUC0-∞在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tmax兩配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)表明差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的幾何均值比值及其90%置信區(qū)間見表3。

表3 空腹?fàn)顟B(tài)下利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0－t 和AUC0－∞經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的（1～2α）置信區(qū)間

餐后試驗(yàn)42 例志愿者完成了兩周期試驗(yàn)，納入BE 集。脫落6 例：①1 例因家中有急事，于第一周期給藥當(dāng)天凌晨離開I 期病房，未服藥；②有2 例第一周期結(jié)束至第二周期入住I 期病房前，未能聯(lián)系上，中止第二周期試驗(yàn)；另1 例在清洗期自行用藥，因上呼吸道感染中止第二周期試驗(yàn)；③還有2例在清洗期自行用藥，中止第二周期試驗(yàn)。納入BE集的42 例受試者的利培酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。42 例受試者帕利哌酮Cmax和AUC0-t在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；41 例受試者帕利哌酮AUC0-∞在給藥序列間、制劑間、周期間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tmax兩配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)表明，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的幾何均值比值及其90%置信區(qū)間見表3。

2.4 安全性評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)的安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)含生命體征（包括血壓、脈搏及體溫）、體重、實(shí)驗(yàn)室檢查及心電圖、不良事件等。空腹試驗(yàn)受試制劑有40 例受試者共發(fā)生64 件不良反應(yīng)，3 例低血壓嚴(yán)重程度為2 級(jí)，其余均為1 級(jí)；參比制劑有39 例受試者發(fā)生63 件不良反應(yīng)，1 例暈厥嚴(yán)重程度為3 級(jí)，蛋白尿?yàn)? 級(jí)，其余均為1 級(jí)。餐后試驗(yàn)受試制劑有39 例受試者共發(fā)生69 件不良反應(yīng)，嚴(yán)重程度均為1 級(jí)；參比制劑有42 例受試者發(fā)生74 件不良反應(yīng)，嚴(yán)重程度均為1 級(jí)。不良反應(yīng)包括鎮(zhèn)靜、血催乳素異常、頭暈、血壓降低等。受試制劑和參比制劑總體耐受性良好。

3 討論

利培酮是臨床常用的治療精神分裂癥藥物，屬于基本藥物目錄品種。根據(jù)《國務(wù)院辦公廳關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的意見》（國辦發(fā)〔2016〕8 號(hào)）要求開展一致性評(píng)價(jià)工作。帕利哌酮是利培酮的活性代謝物，具有良好的藥理活性，依據(jù)《以藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[4]，本試驗(yàn)采用LC-MS/MS 同時(shí)檢測(cè)血漿中的利培酮和帕利哌酮濃度，以利培酮評(píng)價(jià)生物等效性，帕利哌酮的相關(guān)數(shù)據(jù)用于進(jìn)一步支持臨床療效的可比性。

本研究比較了健康志愿者在空腹和餐后狀態(tài)下、口服1 mg 受試或者參比利培酮片后體內(nèi)利培酮和帕利哌酮的藥代動(dòng)力學(xué)，其得到的結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5，6]，為后續(xù)研究提供了依據(jù)。

[1-2α]置信區(qū)間法計(jì)算得出空腹?fàn)顟B(tài)下受試制劑和參比制劑利培酮的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的幾何均值比的90%置信區(qū)間分別為96.68%～109.80%、97.15%～109.62%、96.97%～109.28%，帕利哌酮分別為97.83%～105.49%、96.93%～105.11%、96.68%～105.42%；餐后狀態(tài)下利培酮分別為87.70%～105.54%、98.31%～109.01%、98.70%～109.95%，帕利哌酮分別為98.38%～105.54%、99.22%～106.28%、99.69%～106.54%。均滿足藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則中生物等效性的等效范圍要求（80.00%～125.00%），表明江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的利培酮片（1 mg）與原研Janssen Pharmaceuticals，Inc 生產(chǎn)的利培酮片具有生物等效性。