陳召慧 張成華 王萍 李蘭 朱慶均

摘 要：目的：研究羅勒多糖對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織病理的影響。方法：將40只C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，羅勒多糖高、中、低劑量組。模型組和羅勒多糖組小鼠，氣管注射博來霉素（1.5mg/kg），誘導(dǎo)其肺纖維化，假手術(shù)組注射等量生理鹽水同法造模。羅勒多糖組小鼠每天用100、50、25mg/kg羅勒多糖，假手術(shù)組、模型組小鼠同法給藥相應(yīng)劑量的生理鹽水，每天給藥。造模28d后處死小鼠，肺組織病理切片進(jìn)行HE和Masson染色，觀察肺泡炎和肺纖維化程度，ELISA檢測(cè)肺組織羥脯氨酸含量。結(jié)果：與模型組相比，羅勒多糖不同劑量組小鼠肺組織膠原染色明顯減少，肺泡間隔增厚程度較輕，區(qū)域性實(shí)質(zhì)性病變少見，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，纖維化程度均有所減輕，羥脯氨酸含量下降，中、高劑量組優(yōu)于低劑量組。結(jié)論：羅勒多糖能減輕博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織炎癥和肺纖維化程度，是一種潛在的可用于特發(fā)性肺纖維化（IPF）治療的中藥提取物。

關(guān)鍵詞：羅勒多糖;肺纖維化;小鼠;博萊霉素

特發(fā)性肺纖維化（IPF）發(fā)病率高，預(yù)后差，晚期患者中位生存期僅3～5年[1]。IPF的誘發(fā)病因不明，目前認(rèn)為年齡（大于60歲）、性別（常見于男性）和某些相關(guān)致病風(fēng)險(xiǎn)因素導(dǎo)致的基因異常與IPF發(fā)病密不可分[2]。在過去的10年，IPF的發(fā)病率和患病率總體呈上升趨勢(shì)。從全球來看，發(fā)病率總體在1/10 000左右[3]，治療以肺移植為根治手段，但由于供體較少，有局限性[4]。目前用于治療IPF的藥物很少，全球范圍內(nèi)僅有吡啡尼酮和尼達(dá)尼布被批準(zhǔn)用于特異性地治療IPF[5-6]，但療效并不理想。近年來，研究者們利用動(dòng)物模型或細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖、紅芪多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖、高山紅景天多糖、百合多糖等多種植物多糖具有抗IPF作用[7-13]，但關(guān)于羅勒多糖抗IPF的研究尚未見他人報(bào)道。利用博萊霉素誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠作為IPF動(dòng)物模型，對(duì)中藥羅勒多糖提取物治療IPF的藥效作用進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8周齡C57BL/6J雄性小鼠，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司（合格證號(hào)：NO.37009200003495）;戊巴比妥鈉，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，用生理鹽水配制成2%溶液后按照2 mL/kg體重腹腔注射;注射用鹽酸博萊霉素，日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，每瓶15mg，造模用量為1.5mg/kg。羅勒，購(gòu)自山東中魯醫(yī)院。羥脯氨酸（HYP）Elisa試劑盒，由北京方程生物公司提供。

羅勒多糖的制備：稱取100g羅勒藥材粉碎成粗粉，依次添加10、8、8倍量蒸餾水加熱回流提取3次，每次提取溫度90℃，時(shí)間2h，過濾，合并，減壓濃縮至適量體積，攪拌滴加總體積80%乙醇，收集沉淀，依次使用乙醇，丙酮清洗，真空冷凍干燥，得羅勒多糖，得率為9.1%，苯酚硫酸法測(cè)得多糖含量為28%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模及給藥

將40只C57BL/6J雄性小鼠，體重20±5g，溫度20～25℃、濕度50%～70%狀態(tài)下，普通飼料育飼3天。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、羅勒多糖高、中、低劑量組，每組8只。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，鈍性分離肌肉、組織直至暴露氣管。按照1.5mg/kg劑量用0.1mL加樣器抽取用生理鹽水配制的博萊霉素溶液100μL，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管。注入結(jié)束后將鼠板直立并立即旋轉(zhuǎn)抖動(dòng)，讓藥液在小鼠肺內(nèi)均勻分布[14-15]，假手術(shù)組小鼠同法注入100μL生理鹽水?？p合切口，右側(cè)臥靜置，待其自然蘇醒。造模7天后開始灌胃給藥，小鼠用藥量按“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比指表”換算，計(jì)算出小鼠日服用劑量為50mg/kg，確定該等效劑量為羅勒多糖中劑量組。模型組和假手術(shù)組灌胃生理鹽水0.3mL/d、羅勒多糖高、中、低劑量組每天分別按照100、50、25mg/kg等容量灌胃羅勒多糖。連續(xù)灌胃21d，手術(shù)后第28天末次給藥后2h處死小鼠，取肺組織。

1.3 病理形態(tài)學(xué)觀察

小鼠處死后取肺組織，用生理鹽水洗凈組織表面，將肺組織置于4%多聚甲醛溶液4℃固定，石蠟包埋切片。切片脫蠟后，依次放入二甲苯脫蠟、梯度酒精和蒸餾水中復(fù)水并洗滌。之后將其中1份切片放入蘇木素中浸染3min，1%鹽酸酒精分化，0.6%氨水返藍(lán)，然后放入伊紅染液侵染1～3min后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，即為HE染色，用于觀察小鼠肺組織病理改變。另一份用Weigert氏鐵蘇木素浸染5min，1%鹽酸酒精分化，返藍(lán)后，用內(nèi)麗春紅酸性品紅液浸染5～10min，磷鉬酸水溶液處理3～5min，苯胺藍(lán)復(fù)染5min，1%冰醋酸分化處理1min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，即為Masson染色，觀察小鼠肺部膠原組織面積，反應(yīng)肺組織纖維化程度。

1.4 ELISA法檢測(cè)肺組織HYP分泌水平

取各組小鼠相同肺葉肺組織50mg，冰浴條件下用PBS勻漿，離心取上清，采用ELISA法測(cè)定肺組織勻漿上清液中HYP含量，測(cè)定方法按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。具體操作如下：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔和空白孔。標(biāo)準(zhǔn)孔中標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋成5個(gè)濃度梯度;空白孔作為對(duì)照孔，不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同。每孔中加入100μL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品或組織勻漿樣品，加入50μL酶標(biāo)抗體工作液后37℃孵育60min，去離子水和稀釋的洗液徹底漂洗，甩干殘余洗液后在每孔中分別加入50μL顯色劑A和50μL顯色劑B，輕搖混勻，避光置于室溫下20min，加入50μL反應(yīng)終止液，輕輕搖勻后用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度值（OD值）。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中HYP濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS17.0 進(jìn)行，以±s表示計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，取P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 HE染色結(jié)果

假手術(shù)組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡無(wú)出血點(diǎn)，形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)正常，膠原沉積較少;模型組小鼠肺組織炎癥改變和纖維組織增生，多數(shù)肺泡腔變窄、結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡間隔增厚;羅勒多糖提取物各組與模型組相比，膠原沉積減少，實(shí)質(zhì)性病變少見，肺泡間隔略微增厚，結(jié)構(gòu)較正常（圖1）。

2.2 Masson染色結(jié)果

發(fā)生肺纖維化時(shí)，肺泡間細(xì)胞基質(zhì)沉積，膠原纖維增多，Masson染色后綠色或藍(lán)色面積增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組膠原染色面積明顯增多;與模型組比較，羅勒多糖提取物各組膠原染色明顯減少（圖2）。

2.3 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞外膠原蛋白沉積是肺纖維化的主要病理改變之一。膠原蛋白中HYP比例高，檢測(cè)HYP含量可以間接反映肺纖維化程度。ELISA結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織勻漿中HYP含量明顯高于假手術(shù)組，羅勒多糖三個(gè)劑量組小鼠肺組織HYP含量明顯低于模型組（附表）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，手術(shù)切開氣管內(nèi)注入博萊霉素成功誘導(dǎo)了小鼠肺纖維化病變，模型組小鼠肺組織炎癥和纖維組織變化明顯，多數(shù)肺泡腔壁增厚異常、正常功能結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，肺泡間隔厚度增加，膠原染色增加，肺織織勻漿HYP含量增高。近年來，研究者們利用動(dòng)物模型或細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)了多種植物多糖具有抗IPF作用[7-13]。中藥羅勒作為藥食兩用的代表中藥之一，從中分離、提取的活性成分羅勒多糖，大到在抗腫瘤相關(guān)病癥、降血糖、降血脂以及抗血栓等重大疾病治療方面，小到體外細(xì)菌抑制、調(diào)節(jié)人體免疫活性等生物疾病防御方面，都發(fā)揮了重要的生物活性[16-19]。本研究結(jié)果表明，羅勒多糖能減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺部炎性細(xì)胞和纖維化程度，降低膠原蛋白的沉積，減少肺織織勻漿HYP含量。

本研究表明，羅勒多糖能夠降低博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化肺部炎癥和纖維化，可作為中藥提取物，并成為在IPF治療中具有潛在治愈作用的藥物，為求證其藥效作用，下一步應(yīng)開展相關(guān)的肺纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究，以求獲得更詳盡的藥理和臨床證據(jù)。此外，羅勒多糖抑制肺纖維化的作用機(jī)理也有待于進(jìn)一步闡明。

目前，很多研究著重于羅勒揮發(fā)油的提取和成分分析方面，羅勒的不同提取物應(yīng)用于食品、藥品及化妝品領(lǐng)域，在國(guó)內(nèi)常常作為蔬菜而被人們所食用，可作為一種新型保健食物進(jìn)行深入開發(fā)。

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Abstract：Objective To study the anti-pulmonary fibrosis activity of basil polysaccharide in vitro and in vivo.Method Forty male C57BL/6J mice were randomly divided into a sham operation group，a model group，and a high，medium and low dose group of basil polysaccharide.Mice in the model group and basil polysaccharide group were injected with bleomycin （1.5mg/kg） by trachea to induce pulmonary fibrosis.The sham operation group was injected with the same amount of normal saline to make the model.The mice in the basil polysaccharide group were administrated with 100，50，and 25 mg/kg basil polysaccharides respectively.The mice in the sham operation group and the model group were orally administered with the corresponding dose of normal saline.GMice were sacrificed 28 days after modeling.Pathological sections of lung tissue were stained with HE and Masson to observe the degree of alveolar inflammation and pulmonary fibrosis.The content of hydroxyproline in lung tissue was measured by ELISA to indirectly reflect the degree of pulmonary fibrosis.Result Compared with the model group，mice with different doses of basil polysaccharides had significantly reduced collagen staining，milder alveolar septal thickening，rare regional parenchymal lesions，reduced inflammatory cell infiltration，and reduced fibrosis.The proline content decreased，and the middle and high dose groups were better than the low dose group.Conclusion Basil polysaccharide can reduce the degree of pulmonary fibrosis of mice induced by bleomycin and is a potential extract of herb medicine in treating pulmonary fibrosis.

Keywords：basil polysaccharide;pulmonary fibrosis;mice;bleomycin

（責(zé)任編輯 李婷婷）