陳晨 公維一 毛宏梅 李巖

摘 要：目的：對蜂膠靈芝毒理學(xué)安全性進行評價，為蜂膠靈芝食用安全提供科學(xué)依據(jù)。方法：通過急性經(jīng)口毒性試驗、Ames試驗、骨髓細胞微核試驗、精子畸形試驗和大鼠30d喂養(yǎng)試驗等毒理學(xué)評價試驗，評估蜂膠靈芝的食用安全性。結(jié)果：蜂膠靈芝對大鼠經(jīng)口急性毒性的最大耐受量大于20.0g/kg·BW。遺傳毒性試驗——小鼠骨髓微核試驗、Ames試驗和精子畸形試驗結(jié)果未觀察到受試物引起致突變作用，大鼠30d喂養(yǎng)試驗結(jié)果未觀察到毒性反應(yīng)。結(jié)論：蜂膠靈芝急性毒性分級屬無毒級，無遺傳毒性，在該試驗研究劑量和條件下，蜂膠靈芝未見明顯毒性作用。

關(guān)鍵詞：蜂膠靈芝;急性毒性;遺傳毒性;30d喂養(yǎng)試驗

蜂膠是蜜蜂從樹干破皮傷口處或植物芽孢中采集的樹脂（樹膠），混入蜜蜂口器腺體的分泌物，與花粉、蜂蠟等加工而成的一種膠狀物質(zhì)。蜂膠含有樹脂、蜂蠟和黃酮類化合物，具有抗癌性、抗氧化性、抑菌活性和抗病毒等生物學(xué)功能[1-3]。作為一種重要的藥食用真菌，靈芝具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗肝損傷的作用[3-4]。市場上有很多靈芝和蜂膠復(fù)合產(chǎn)品，關(guān)于這個產(chǎn)品的研究多為降血糖[5]和降血脂[6]等方面，安全性評價的研究較少。本研究以靈芝和蜂膠組成的復(fù)合物為原料，通過急性經(jīng)口毒性試驗、Ames試驗、骨髓細胞微核試驗、精子畸形試驗和大鼠30d喂養(yǎng)試驗等毒理學(xué)評價試驗，評估蜂膠靈芝的食用安全性，為其進一步在保健食品中使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

受試物：蜂膠靈芝膠囊內(nèi)容物為棕色粉末，陰涼干燥處保存。該受試物人體食用的推薦量是1.2g/d，成人按60kg體重計，推薦攝入量為每天0.02g/kg·BW。

1.2 實驗動物和實驗條件

SPF級健康昆明種小鼠和SPF級SD大鼠，均購買自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，其生產(chǎn)許可證號為SCXK（軍）2012-0004。急性毒性試驗選用SD大鼠20只，雌雄各半，體重180～220g;50只昆明小鼠，雌雄各半，用于微核試驗，體重25～30g;雄性昆明小鼠用于精子畸形試驗，共30只，體重25～35g;大鼠30d喂養(yǎng)試驗選用斷乳SD大鼠80只。飼養(yǎng)地點：中國疾病預(yù)防控制中心動物房，級別：屏障環(huán)境，溫度20～24℃，相對濕度40%～70%，許可證號：SYXK（京）2014-0043。Co60輻照處理的SPF級鼠維持飼料，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號：SCXK-（京）2014-0010。根據(jù)30d喂養(yǎng)試驗設(shè)計飼料中受試物摻入劑量，委托北京科澳協(xié)力飼料有限公司配制飼料后，經(jīng)Co60輻照處理，許可證號：SCXK-（京）2014-0010。

1.3 實驗菌株

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102是Ames試驗所使用的菌株，經(jīng)過鑒定菌株符合要求。

1.4 主要儀器與試劑

電子天平、AC2-YSI生物安全柜、SPX-250恒溫培養(yǎng)箱、WNB29恒溫水浴鍋、HVE-50蒸汽壓力消毒器、生物顯微鏡、全自動血細胞分析儀（XT-1800i）、日立7080全自動生化分析儀、離心機、病理設(shè)備（全自動脫水機VIP-E150F、自動包埋機TEK-CC/TEK-EC、石蠟切片機、全自動染色機ST5010、全自動封片機SCA-5600）、ZEISS生物顯微鏡等。AMES實驗陽性物為2-氨基芴（北京索萊寶科技有限公司）、甲基磺酸甲酯（百靈威科技有限公司）、1，8-二羥基蒽醌（百靈威科技有限公司）、敵克松（Sigma）。

1.5 試驗方法

1.5.1 大鼠急性毒性試驗 按照最大耐受量法進行，試驗用20只SD大鼠，雌雄各半，體重為180～220g。稱取受試物50.0g，加蒸餾水至100mL，終濃度為0.5g/mL。實驗前動物隔夜空腹（禁食16h，不限制飲水），以20.0mL/kg·BW灌胃量進行，1日灌胃2次，2次灌胃之間間隔4h，受試物給予劑量是20.0g/kg·BW。連續(xù)觀察14d，同時記錄大鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.5.2 遺傳毒性試驗

（1）Ames試驗：鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102用于試驗，并經(jīng)過鑒定是符合要求的，S-9混合液是體外代謝活化系統(tǒng)，試驗條件分為加與不加S-9。試驗設(shè)8、40、200、1 000、5 000μg/皿5個劑量組。試驗還包括陽性對照組、溶劑對照（DMSO）組以及空白對照組。按照平板摻入法進行試驗，每個組別需要3個平行皿，計數(shù)每皿的回變菌落數(shù)。如果試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)受試物回變菌落數(shù)達到溶劑對照菌落數(shù)的2倍以上，并且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系的時候則結(jié)果定為陽性。整個試驗需要在相同條件下重復(fù)進行2次。

（2）骨髓嗜多染紅細胞微核試驗：試驗需向小鼠間隔24h兩次經(jīng)口灌胃受試物。昆明小鼠50只，雌雄各半，體重25～30g，根據(jù)體重將小鼠隨機分成5組，每組10只。受試物分成3個劑量組，分別是2.5、5.0、10.0g/kg·BW，試驗還設(shè)有環(huán)磷酰胺陽性對照組（40mg/kg·BW）以及蒸餾水陰性對照組。高劑量組試驗稱取20.0g受試物溶于蒸餾水至40mL，中、低劑量組試驗以蒸餾水2倍倍比稀釋高劑量組受試物，終濃度分別為0.50、0.25、0.125g/mL，小鼠灌胃量為20mL/kg·BW。末次給予受試物后的6h處死小鼠，取小鼠胸骨骨髓，使用小牛血清涂片、由甲醇固定、進行Giemsa染色。在顯微鏡下，對每只動物計數(shù)200個嗜多染紅細胞（PCE），并且計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值（PCE/NCE）;然后每只動物需計數(shù)嗜多染紅細胞（PCE）1 000個，以含微核的PCE千分率計為微核發(fā)生率，并對各個組進行泊松分布的統(tǒng)計分析。如果試驗組微核率和陰性對照組微核率相比升高有統(tǒng)計學(xué)意義，還具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，那么結(jié)果判定為陽性。

（3）小鼠精子畸形試驗：30只性成熟雄性小鼠，體重25～35g，按體重隨機分成5組，每組6只小鼠。受試物的3個劑量組分別是2.5、5.0、10.0g/kg·BW，試驗還設(shè)有環(huán)磷酰胺陽性對照組（40mg/kg·BW）以及蒸餾水陰性對照組。高劑量組將20.0g樣品溶于蒸餾水至40mL，中、低劑量組依次使用蒸餾水做2倍倍比稀釋，試驗的終濃度分別是0.50、0.25、0.125g/mL，灌胃量為20mL/kg·BW，每天灌胃1次，灌胃5d。第1次灌胃后的第35天，在每組中隨機選取5只小鼠，頸椎脫臼處死后，取小鼠兩側(cè)附睪的精子濾液，進行常規(guī)的制片和鏡檢。對每只動物進行1 000個結(jié)構(gòu)完整精子的計數(shù)，并且計算各組的精子畸形率（百分率表示），然后使用χ2檢驗進行統(tǒng)計處理。如果試驗組小鼠精子畸形率與陰性對照組相比升高有統(tǒng)計學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判定為陽性結(jié)果。

1.5.3 大鼠30d喂養(yǎng)試驗

（1）劑量選擇與受試物給予方式：選用斷乳SD大鼠80只，雌雄各半，適應(yīng)環(huán)境后隨機分為4組，低、中、高3個劑量組和對照組，每組20只大鼠。低、中、高3個劑量組按照樣品的人體推薦量而設(shè)立，分別是0.5、1.0、2.0g/kg·BW（即人體推薦量25、50、100倍）。按大鼠每日100g體重進食10g飼料計算，低、中、高劑量組分別取75、150、300g的受試物添加鼠維持飼料至15kg。對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。大鼠自由飲食，單籠喂養(yǎng)，試驗觀察30d。

（2）試驗方法：試驗每天觀察和記錄動物生長狀況，大鼠體重每周稱1次，進食量每周記錄。試驗結(jié)束，動物空腹過夜，稱解剖前體重，腹主動脈采血2份，1份是抗凝血，使用全自動血細胞分析儀檢測大鼠白細胞計數(shù)及其分類、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白;另一份為非抗凝血，分離血清，使用全自動生化分析儀來檢測大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽固醇、尿素氮、甘油三酯、肌酐、白蛋白、總蛋白、血糖。對動物進行大體觀察，取肝、脾、腎以及睪丸進行稱重，計算臟/體比（按百克體重來計算），取腎、脾、肝、胃和十二指腸、卵巢或睪丸進行組織病理學(xué)檢查。對各劑量組大鼠做大體檢查并未觀察到明顯的病變和生化指標的改變情況下，試驗僅做高劑量組和對照組動物主要臟器病理組織學(xué)的檢查，如果發(fā)現(xiàn)有病理學(xué)的改變，然后再進行中、低劑量組大鼠相應(yīng)器官的組織學(xué)檢查。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析使用 SPSS軟件進行，使用泊松分布進行微核試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析，使用χ2檢驗進行小鼠精子畸形試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析。30d喂養(yǎng)試驗數(shù)據(jù)首先做方差齊性檢驗，如果各個組的方差齊，那么使用單因素方差分析進行總體的比較，顯著性水平α=0.05，當發(fā)現(xiàn)差異時則使用Dunnett法進行各個劑量組與對照組之間的比較。如果方差不齊，那么對原始數(shù)據(jù)進行變量轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后若滿足數(shù)據(jù)方差齊性后，則用轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若轉(zhuǎn)換后方差齊性仍不能滿足，則使用其他統(tǒng)計方法如 Brown-Forsythe檢驗或Welch檢驗等。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠經(jīng)口急性毒性試驗

大鼠灌胃給予受試物20.0g/kg·BW，觀察14d，未觀察到明顯的中毒癥狀，14d內(nèi)沒有大鼠死亡。表1顯示，該受試物對雌雄大鼠急性經(jīng)口最大耐受量（MTD）大于20.0g/kg·BW。由急性毒性分級標準得出，這個樣品是屬于無毒級。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 Ames試驗 對照平皿的回變菌落數(shù)是在正常范圍內(nèi)，兩次試驗中各個劑量受試物組的回變菌落數(shù)未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，沒有劑量-反應(yīng)關(guān)系，也未見某一測試點可重復(fù)的并有統(tǒng)計學(xué)意義的陽性反應(yīng)，所以在加與不加S-9的時候，均未觀察到這個樣品對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA 102四株試驗菌株有致突變作用。

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 由表2可以看出，各劑量受試物組的PCE與成熟紅細胞比例不低于陰性對照組的20%，表明受試物在實驗劑量下無細胞毒性;陽性對照組雌、雄小鼠的微核發(fā)生率顯著高于陰性對照組（P<0.01），而與陰性對照組相比，受試物各個劑量組微核率無顯著性差異（P>0.05），表明該受試物對小鼠骨髓嗜多染紅細胞沒有致突變作用。

2.2.3 精子畸形試驗 由表3～4可以看出，各劑量受試物組昆明小鼠精子畸形率和陰性對照組相比無顯著性差異（P >0.05）。然而與陰性對照組相比，環(huán)磷酰胺陽性對照組有顯著性差異（P<0.01），表明該受試物沒有致小鼠精子畸形的作用。

2.3 大鼠30d喂養(yǎng)試驗

2.3.1 生長狀況及食物利用率 以0.5、1.0、2.0g/kg·BW劑量的蜂膠靈芝膠囊摻入飼料給予大鼠30d，各組動物活動、生長正常，被毛濃密有光澤。由表5～8可見，雌雄各個劑量組動物的體重、周食物利用率、周進食量、總食物利用率與對照組比較均未觀察到顯著性差異（P>0.05）。

2.3.2 血液學(xué)指標 由表9～10可見，以0.5、1.0、2.0g/kg·BW劑量的蜂膠靈芝膠囊摻入飼料給予大鼠30d，雌雄各劑量組血液學(xué)指標與對照組比較均無顯著性差異（P>0.05）。

2.3.3 血生化指標 由表11～12可見，以0.5、1.0、2.0g/kg·BW劑量的蜂膠靈芝膠囊灌胃給予大鼠30d，雄性2.0g/kg·BW劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著低于對照（P<0.01），雌性0.5g/kg·BW劑量組肌酐顯著低于對照（P<0.01），但是上述指標的降低并沒有生物學(xué)意義。除此之外，與對照組比較，其余雌雄大鼠各個劑量組血生化指標均沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.3.4 組織病理學(xué)檢查結(jié)果 對照組和高劑量組大鼠的脾、腎、肝、胃和十二指腸、卵巢、睪丸等臟器進行組織病理學(xué)檢查。檢查結(jié)果為：（1）肝：對照組和高劑量組所有動物的肝臟正常結(jié)構(gòu)能夠清晰辯識出來，肝小葉排列整齊，并且肝細胞以中央靜脈為軸心呈大致輻射狀走向。個別動物出現(xiàn)了肝細胞的點狀壞死（對照組2/20例、高劑量組2/20例）。上面所述肝臟的病理學(xué)改變是動物自身常見的病變，并且高劑量組和與對照組大鼠檢查結(jié)果無明顯差異，故認為該病變與受試物是無關(guān)的。（2）腎：腎臟的結(jié)構(gòu)能夠清晰識別，腎單位呈均勻分布。部分標本（對照組3/20例，高劑量組3/20例）局灶性腎小管變性及再生。上述腎臟病理學(xué)改變對照組和高劑量組之間無顯著差別，考慮為動物自發(fā)病變。（3）脾：正常脾組織結(jié)構(gòu)易于辯認，脾組織未見明顯病理變化。（4）胃及十二指腸、睪丸和卵巢：對照組和高劑量組所有動物胃及十二指腸各層組織可清晰辨認，粘膜和粘膜下層等各層結(jié)構(gòu)正常，未見出血、壞死或炎性滲出;睪丸結(jié)構(gòu)正常，可見各級生精細胞，未見出血、壞死及精細胞發(fā)育異常;卵巢結(jié)構(gòu)正常，可見各階段卵泡和成熟黃體，未見卵泡的發(fā)育異常以及組織內(nèi)出血和炎癥。綜上認為，腎、脾、胃及十二指腸、睪丸（或卵巢）均未出現(xiàn)明顯病理變化。故未觀察到由蜂膠靈芝引起的脾、肝、腎、胃和十二指腸、卵巢（或睪丸）等臟器毒性病理改變。

3 討論

Zhang等[7]研究表明，靈芝多糖沒有致突變性，30d喂養(yǎng)試驗未見明顯毒性。Ramadan等[8]研究表明，蜂膠和番茄花的乙醇提取物連續(xù)灌胃大鼠8周并未發(fā)現(xiàn)肝腎毒性，對小鼠未發(fā)現(xiàn)毒性作用。程浩[9]研究表明，蜂膠軟膠囊急性毒性屬實際無毒級，無遺傳毒性試驗。靈芝和蜂膠復(fù)合產(chǎn)品有降糖和降血脂的功效，但是安全性評價資料較少。在本實驗條件下，蜂膠靈芝對大鼠急性經(jīng)口最大耐受量是大于20.0g/kg·BW的。由急性毒性分級標準得出，該樣品是屬于無毒級的。小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、Ames試驗和精子畸形試驗均未觀察到這個樣品具有致突變的作用。大鼠30d喂養(yǎng)試驗觀察到各組動物生長發(fā)育、活動正常，動物周進食量、體重、食物利用率、血液生化、血液學(xué)指標與對照組比較均沒有顯著性差異（P>0.05）。組織病理學(xué)檢查沒有觀察到攝入受試物而引起的異常改變。在本次實驗的條件下，蜂膠靈芝沒有觀察到明顯的毒性作用，本項研究為蜂膠靈芝用于保健食品研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

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Abstract：Objective To comprehensively assess the toxicological safety of propolis and Ganoderma lucidum.Method The safety of propolis and Ganoderma lucidum was assessed through acute toxicity test，Ames test，Mouse Bone Marrow Polychromatic Erythrocyte Micronucleus Test，Mouse Sperm Abnormality Test and rat 30d feeding test.Result Rat acute toxicity test showed that the maximum tolerated dose（MTD）of propolis and Ganoderma lucidum in female and male rats was greater than 20.0g/kg·BW，and the sample was non-toxic according to the acute toxicity grading criteria.The results of three genotoxicity tests showed no mutagenic effect.Rat 30d feeding test showed that animal activity and growth were not abnormal.In addition，no adverse effects of propolis and Ganoderma lucidum were observed on animal weight，food intake，food utilization，blood routine，blood biochemistry，organ weight，organ/weight ratio，and histopathological examination results.Conclusion No obvious adverse effects of propolis and Ganoderma lucidum were observed.

Keywords：propolis and Ganoderma lucidum;acute toxicity;genotoxicity;30d feeding test

（責任編輯 唐建敏）