黃政偉，季曉克，黃文鉛，黃思琪，李義孟，吳燚陽，戴克智，張啟瑜

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015；溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州325027，2.超聲影像科，3.肝膽外科；4.溫州醫(yī)科大學附屬康寧醫(yī)院 精神衛(wèi)生研究所，浙江 溫州 325007）

人抗原R（human antigen R，HuR）是一種RNA結(jié)合蛋白，屬于胚胎致死性視覺異常（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家族，在體內(nèi)廣泛表達[1]。它含有3個保守的RNA識別基序（RNA recognition motifs，RRMs），其中在RRM2和RRM3之間有一鉸鏈區(qū)，內(nèi)含由52個氨基酸殘基組成的HuR核質(zhì)穿梭區(qū)，對其結(jié)合mRNA的能力有重要影響[2]。正常情況下，HuR蛋白主要定位在細胞核[3]，但在細胞應(yīng)激狀態(tài)下，比如細胞因子、氧化應(yīng)激、低氧和放射性損傷等刺激時，可能通過下面的兩種機制——染色體區(qū)域維持蛋白1（chromosome maintenance protein，CRM1）或HuR核質(zhì)穿梭序列（HuRnucleocytoplasmic shuttling sequence，HNS），HuR蛋白出核發(fā)揮作用[4]。在細胞質(zhì)中，HuR蛋白特異性地與其靶mRNA分子3'UTR的AU富集區(qū)（AU-rich element，ARE）結(jié)合，改變RNA的空間結(jié)構(gòu)，抑制脫腺苷化，提高mRNA的穩(wěn)定性，促進蛋白表達[5]。

HuR在肝臟多種疾病中均扮演著重要的角色[6]。如在肝炎中，HuR可以促進炎癥介質(zhì)TLRs、IL-6、IL-8、TNF-α、iNOS和COX-2的表達，另外還可調(diào)控巨噬細胞的活性，因此被認為是一種關(guān)鍵的促炎因子[7-8]。對于非酒精性脂肪肝，HuR可通過結(jié)合C/EBPβ的3’UTR，在早期脂肪生成時影響其核質(zhì)運輸和mRNA穩(wěn)定性[9-10]，而C/EBPβ基因的肝臟特異性敲除表明其有對抗肝臟甘油三酯沉積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和炎癥的作用[11]。HuR基因的敲降會直接降低APOA4-AS和APOA4的表達[12]，進而調(diào)節(jié)脂質(zhì)和血糖的代謝[13]。有更多的研究表明，HuR基因在病毒性肝炎、酒精性肝病、肝纖維化、肝癌、肝再生等過程中都發(fā)揮著重要作用[6]。

本研究利用Cre-LoxP條件基因敲除技術(shù)，構(gòu)建肝細胞特異性HuR基因敲除小鼠模型，探討在肝細胞中該基因的特異性缺失對肝功能的影響，為后續(xù)HuR基因與肝臟相關(guān)疾病之間的關(guān)聯(lián)性研究提供動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級HuRfl/fl雄性小鼠4只（B6.129-Elavl＜tm1Thla＞/J:stock number:021431）[14]，SPF級Alb-Cre小鼠雌雄各1只[B6.Cg-Tg（Alb-Cre）21Mgn/J:stock number:003574][15]，購自美國Jackson實驗動物中心。高脂配方含40%脂肪，普通喂養(yǎng)采用一般維持飼料。采取12 h/12 h的晝夜交替方式進行。實驗過程中，小鼠相關(guān)的操作處置均按照中華人民共和國科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定進行，符合動物倫理學管理要求。

1.2 主要試劑

蛋白酶抑制劑（瑞士Biotool上海分公司）；1 mol/L Tris-HCl（pH=6.8）、1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1 mol/L Tris-HCl（pH=7.4）（上海捷瑞生物工程有限公司）；山羊抗小鼠熒光二抗-488、山羊抗兔熒光二抗-594（美國Southernbiotech公司）；小鼠抗人HuR抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；小鼠抗人Vinculin抗體（美國Sigma公司）；兔抗人、小鼠HNF-4α抗體（英國Abcam公司）；TEMED、過硫酸銨、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PBS緩沖液、SDS、Tween-20（中國碧云天生物技術(shù)有限公司）；Goldview I型核酸染色劑（北京索萊寶科技有限公司），瓊脂糖（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 肝細胞HuR基因特異性敲除小鼠模型的構(gòu)建：通過HuRfl/fl小鼠與Alb-Cre小鼠雜交獲得F1代，PCR法檢測其基因型，選取HuRfl/+/Alb-CreF1代和親代HuRfl/fl回交，選育F2代HuRfl/fl/Alb-Cre和HuRfl/fl小鼠合籠雜交，獲得大量F3代HuRfl/fl/Alb-Cre小鼠（實驗組）和HuRfl/fl小鼠（對照組）。

1.3.2 小鼠基因型檢測：取小鼠直徑約5 mm的耳組織，加入300 μL 8 mmol/L NaOH，置于95 ℃金屬浴，30 min后取出，冷卻至室溫，加入30 μL pH 7.5 Tris-HCl，12 000 r/min，4 ℃離心10 min。PCR擴增體系（10 μL）：2×Taq Mix 5 μL，引物各0.5 μL，模板0.5 μL。采取擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶大小來鑒定小鼠基因型。鑒定引物見表1。

1.3.3 小鼠HuR蛋白水平檢測：取成年小鼠新鮮肝臟，經(jīng)液氮快速冷凍后碾磨成粉，取適量加入強RIPA試劑（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100、1% 脫氧膽酸鈉、0.1%SDS，并在使用前加入1 mmol/L PMSF，1×蛋白酶抑制劑混合液（PIC），0.5 mol/L蔗糖，冰上裂解30 min。12 000 r/min，4 ℃離心10 min。取裂解液上清，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，95 ℃ 5 min變性。樣品經(jīng)100 V、SDS-PAGE凝膠電泳2 h，200 mA濕轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜上。后經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，分別以鼠抗HuR mAb、鼠抗Vinculin mAb（1:1 000）為一抗，以Goat anti mouse IgG HRP（1:5 000）為二抗，加入顯影劑，拍照顯影。

1.3.4 小鼠肝臟免疫熒光實驗：手術(shù)取HuRfl/fl/Alb-Cre和HuRfl/fl小鼠肝臟，取10 μm厚度進行冰凍切片。經(jīng)55 ℃烘干，4% PFA固定15 min。PBS清洗3次，每次5 min。0.1% Triton X-100/PBS，室溫下通透30 min。PBS清洗3次，每次5 min。封閉液：1%山羊血清+ 2% BSA/PBS室溫封閉30 min。封閉液稀釋一抗鼠抗HuR mAb（1:100）和一抗兔抗HNF-4α（Hepatocyte unclear factor-4α，HNF-4α，肝細胞核因子4α）mAb（1:100），室溫孵育2 h。PBS清洗3次，每次5 min。PBS稀釋熒光二抗（1:500），山羊抗鼠-488和山羊抗兔-594，室溫孵育30 min。PBS清洗3次，每次5 min。在熒光顯微鏡下拍照保存。

1.3.5 小鼠肝臟石蠟切片及HE染色：手術(shù)取HuRfl/fl/Alb-Cre和HuRfl/fl小鼠肝臟，經(jīng)4% PFA，固定過夜。次日流水沖洗24 h。經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯梯度透明凈蠟，包埋后經(jīng)取10 μm切片。切片經(jīng)甲苯梯度復水。蘇木精液染色5 min。流水沖洗5 min。1%鹽酸乙醇分化30 s，蒸餾水洗30 s。0.5%伊紅液染色5 min，蒸餾水洗30 s。經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明。中性樹膠封固，拍照保存。

1.3.6 高脂喂養(yǎng)后小鼠血脂和肝功能檢測：取雄性6周齡HuRfl/fl/Alb-Cre和HuRfl/fl各6只，單籠高脂喂養(yǎng)18周，稱取體重后禁食6 h。異氟烷吸入麻醉后開腹下腔靜脈取血，室溫放置1 h，待血液自然凝固后經(jīng)4 ℃、1 000 g離心10 min分離血清，檢測AST、ALT、TG、HDL-C、LDL-C、血糖。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad prism 7軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，比較兩組樣本的均值，每組樣本量為6個，均采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。蛋白免疫印跡、免疫熒光、HE染色等實驗最少重復3次。蛋白條帶灰度值由Image J軟件讀取，經(jīng)Excel 2019編制公式運算獲得其與內(nèi)參條帶灰度值的比值。

表1 小鼠基因型鑒定引物

2 結(jié)果

2.1 通過基因型篩選獲得HuRfl/fl/Alb-Cre小鼠

提取HuRfl/fl/Alb-Cre和HuRfl/fl小鼠基因組DNA，使用Flox基因和Cre基因特異性引物對小鼠進行基因型PCR鑒定。HuR基因鑒定在385 bp為目的基因，290 bp為野生型基因。Cre基因在280 bp為目的條帶，野生型無Cre條帶，如圖1A。其中HuRfl/fl/Alb-Cre小鼠肝細胞成熟表達白蛋白時，將會同步表達Cre酶，Cre酶將對小鼠肝細胞內(nèi)的HuR基因進行剪切加工，切除HuR第2～5個內(nèi)含子，破壞HuR基因，影響HuR的表達，如圖1B。

2.2 驗證小鼠肝細胞HuR敲除水平

取同籠HuRfl/fl/Alb-Cre和HuRfl/fl小鼠肝臟，經(jīng)碾磨裂解提取蛋白，后經(jīng)蛋白免疫印跡檢測肝臟HuR蛋白的表達量，結(jié)果如圖2A。相對于HuRfl/fl小鼠，HuRfl/fl/Alb-Cre肝臟中HuR的蛋白表達量下降，且兩組表達量差異具有統(tǒng)計學意義（t=14.4，P＜0.001）如圖2B。小鼠肝臟經(jīng)免疫熒光實驗，可見HuRfl/fl小鼠肝臟各細胞HuR蛋白（綠色）表達正常，HNF-4α（紅色）代表肝細胞所在位置。在融合照片中，紅色和綠色基本全部融合為黃色，其他非肝細胞仍為綠色。HuRfl/fl/Alb-Cre小鼠在融合照片中，紅色、綠色不重疊，非肝細胞HuR表達正常，表明肝細胞HuR基因敲除成功，成功建立肝細胞特異性HuR基因敲除小鼠（HuRLKO）。如圖2C。

圖1 小鼠基因型（A）和基因敲除示意圖（B）

2.3 小鼠肝細胞HE染色鏡下結(jié)構(gòu)

相對于同籠HuRfl/fl小鼠，HuRLKO小鼠肝臟中央靜脈周圍肝細胞體積增大，變性水腫，部分氣球樣變，部分細胞核有固縮，全肝肝血竇受擠壓，間隙不明顯，局部有細胞壞死，伴炎癥反應(yīng)，匯管區(qū)肝細胞病變相對較輕，如圖3。

2.4 小鼠高脂喂養(yǎng)后的情況

兩組小鼠高脂喂養(yǎng)體重差異無統(tǒng)計學意義（t=1.473，P＞0.05），但肝體比差異有統(tǒng)計學意義（t=2.62，P＜0.05），HuRLKO小鼠肝體比均值大于HuRfl/fl小鼠。兩組小鼠AST、ALT差異有統(tǒng)計學意義（t=4.757，P＜0.001；t=3.627，P＜0.05），但兩者數(shù)值均在正常范圍。HDL差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.93，P＜0.001），血糖差異具統(tǒng)計學意義（t=2.862，P＜0.01）。兩組小鼠TG和LDL-C差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以上結(jié)果表明HuRLKO小鼠在高脂喂養(yǎng)后肝細胞損傷較HuRfl/fl小鼠重，但兩組肝細胞均未發(fā)生大范圍的損傷。敲除HuR基因影響了肝細胞脂質(zhì)的代謝，經(jīng)高脂喂養(yǎng)18周后，相對于HuRfl/fl小鼠，HuRLKO小鼠脂肪肝更為嚴重。詳細數(shù)據(jù)見表2。

圖2 小鼠肝細胞HuR敲除效率圖

圖3 小鼠肝臟HE染色圖（×20）

3 討論

HuR可以通過多種機制調(diào)節(jié)基因的表達。作為一種RNA結(jié)合蛋白，HuR可以通過結(jié)合與mRNA 3’UTR的AU-rich區(qū)，提高mRNA的穩(wěn)定性，促進蛋白表達[5]。而在c-MycmRNA 3’UTR上，HuR可以募集let7進而抑制c-Myc的表達[16]。此外，有研究表明，HuR對于一些長非編碼RNA和微小RNA的表達也有很重要的調(diào)控作用[17-18]。HuR參與了多種肝病的發(fā)生發(fā)展過程，與之相關(guān)的基因眾多[6]，但缺少一個有效可行的研究模型。Cre-Loxp基因敲除系統(tǒng)在近幾年得到較多應(yīng)用，得益于該系統(tǒng)可以在特定的器官組織或細胞中敲除目標基因，而不影響目標基因在其他器官組織細胞中的表達的特性，關(guān)于基因的研究可以細化到特定的器官組織和細胞內(nèi)，對于基因在不同細胞上的差異化表達研究提供了一個強有力的研究途徑。利用此系統(tǒng)，在HuR基因的1號和2號，5號和6號之間插入Loxp序列，得到HuRfl/fl小鼠[14]，將其與能在成熟肝細胞特異性表達Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠Alb-Cre小鼠[15]雜交，經(jīng)多代基因型鑒定和選育，成功獲得HuRLKO小鼠。

表2 高脂喂養(yǎng)小鼠相關(guān)數(shù)據(jù)表

HuRLKO小鼠和HuRfl/fl小鼠的生長繁殖情況并無明顯差異。無論是作為公鼠或者母鼠，HuRLKO小鼠均能正常繁殖子代，子代均可正常存活。對兩組小鼠肝細胞HuR敲除驗證的實驗表明，HuRLKO小鼠對肝細胞HuR基因的敲除效率高，特異性好。

經(jīng)過18周高脂喂養(yǎng)后，相對于HuRfl/fl小鼠，HuRLKO細胞損傷加重，并表現(xiàn)出脂質(zhì)代謝的障礙。有文獻報道，脂肪細胞特異性HuR基因敲除（HuRAKO）小鼠經(jīng)高脂喂養(yǎng)后血清HDL-C下降[19]，此結(jié)果與本實驗結(jié)果相同。但本研究中高脂喂養(yǎng)HuRLKO和HuRfl/fl小鼠血清中TG和LDL-C的差異并無統(tǒng)計學意義，和上文報道的高脂喂養(yǎng)HuRAKO小鼠血清中TC、TG、LDL均高于HuRfl/fl小鼠的結(jié)果并不相同。由此可見肝細胞HuR參與了脂質(zhì)代謝的過程，但具體機制仍待研究。此外，文獻中糖耐量實驗表明高脂喂養(yǎng)的HuRAKO小鼠在30～120 min內(nèi)血糖均高于HuRfl/fl小鼠，且表現(xiàn)出更強的胰島素抵抗[19]。本研究中高脂喂養(yǎng)脂肪含量（40%）低于上文的60%，但喂養(yǎng)時間（18周）長于上文的16周，HuRLKO小鼠空腹血糖高于HuRfl/fl小鼠，可見肝細胞HuR對血糖代謝和胰島素抵抗亦有影響。

綜上所述，HuRLKO小鼠模型基因敲除特異性高，表型明顯，為研究HuR在肝臟各項疾病的發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色，提供了一個很好的疾病模型。