姜浩東 ，麥明杰 ，趙明一 ，陳瑞平 ，吳楚漫 ，朱 平

［1.廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院），廣州510100；2.華南理工大學醫(yī)學院，廣州 511400；3.中南大學湘雅三醫(yī)院，長沙410006；4.中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣州510700］

提要：造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）獲取相對容易，應用時無組織相容性問題及倫理爭議，在再生醫(yī)學的研究及應用中具有較大的潛力。研究證明，HSCs 具有促進心肌損傷后修復，改善受損心臟功能的作用。心肌梗死后多種細胞因子等生物活性分子及相關信號通路參與HSCs動員、歸巢至心臟。同時，研究表明多種機制可能促進HSCs 發(fā)揮心肌修復作用，如轉分化、細胞融合、旁分泌、促進心外膜細胞發(fā)生上皮間充質轉化等，但其確切機制尚有爭議。本文就近年來關于HSCs 在心肌梗死后動員及發(fā)揮修復作用的機制研究進展作全面概述。

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是我國居民疾病死亡首位原因，約占40%［1］以上。心肌梗死（myocardial infarction，MI）是 CVD 中最危急重的病癥之一，MI 后心肌細胞數(shù)量的減少以及心臟瘢痕組織的增生使心臟收縮能力下降，最終導致心力衰竭。目前的治療手段如溶栓、冠狀動脈（冠脈）旁路移植術、介入治療等都只能挽救瀕臨壞死的心肌，而對已壞死的心肌作用甚微。由于供體稀缺、免疫排斥等局限性，心臟移植（heart transplantation，HT）無法成為臨床常規(guī)治療措施。利用干細胞進行心血管修復為臨床治療MI 提供了新的思路，多種干細胞被證明在MI 方面具有治療潛能［2-3］。

造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）傳統(tǒng)定義為多潛能性干細胞，是一個異質性的群體，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細胞的潛能，是所有血細胞和免疫細胞的始祖。早期對HSCs 的研究主要集中在移植及治療血液病方面，目前這種方法廣泛用于惡性、難治性血液病及遺傳性疾病和某些實體瘤的治療。但最近研究發(fā)現(xiàn)，HSCs 除能夠分化出所有種類的血細胞外還能分化為多種非造血譜系細胞如骨骼肌細胞［4］、肝臟細胞［5］、神經(jīng)元［6］、心肌細胞［7］等。此外，HSCs 獲取相對容易，應用時無組織相容性及倫理爭議，是極具潛力的治療心肌梗死的“種子”細胞來源。

1 心肌梗死后造血干細胞的動員機制

1.1 趨化因子作用

MI 涉及心肌細胞壞死、炎癥以及瘢痕形成，壞死過程伴隨大量細胞因子等生物活性分子釋放。HSCs 歸巢是一個復雜的過程，涉及HSCs 動員、黏附、遷移及定植到缺血心肌部位。整個過程受各種細胞因子、骨髓微環(huán)境等相互作用的影響。趨化因子是一類具有化學引誘物作用的細胞因子，可被分為四個亞家族：CXC（或α-趨化因子），CC（或β-趨化因子），CX3C 和XC，趨化因子家族與G 蛋白偶聯(lián)受體結合后具有介導趨化和細胞歸巢的共性［7］。CCL2 是CC亞家族的成員之一，主要與多種細胞表面表達的CCR2R 結合。MI后血漿CCL2濃度升高，是充血性心力衰竭重要的促炎因子，而心肌細胞內(nèi)過表達CCL2 則可以抑制其促炎作用且對MI后心肌細胞有保護作用［8］。CXCL2 是CXC亞家族成員，與CCL2 類似，CXCL2 也同樣具有雙重作用，CXCL2 和CCL2 都被認為可以在缺血損傷早期募集中性粒細胞，但同時心肌細胞過表達后可以對心肌細胞有保護作用。因此未來的研究要注重如何在避免心肌損傷的情況下最有效地利用若干趨化因子的心肌保護作用。CXCL12 是HSCs 動員過程中重要的信號因子。骨髓中的CXCL12與CXCR4結合可以促使HSCs潴留在骨髓干細胞微環(huán)境中，骨髓CXCL12 的濃度的降低可促使HSCs被趨化至外周血。而MI 后局部CXCL12 的分泌增加同樣會促使骨髓HSCs動員至外周血中［9］。

動物模型表示CXCL12 可以增強MI 小鼠心室功能、改善MI 區(qū)域周邊毛細血管密度［10］。另外有報道稱CXCR4 的拮抗劑如AMD3100 能夠在缺血再灌注損傷后改善心功能恢復，根據(jù)動物實驗結果，AMD3100可以通過破壞骨髓中的CXCL12 與CXCR4 的結合，來促使實驗動物缺血再灌注損傷后第 1 天增加 CXCR4 陽性細胞的動員［11］。而 G-CSF、AMD3100 等可以上調(diào)骨髓細胞中的幾種蛋白水解酶如基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-2、MMP-9、組織蛋白酶G、中性粒細胞彈性蛋白酶等，它們可以水解切割滅活SDF-1 和CXCR4，來解除其“錨定”的作用。另外AMD3100 可能通過增加動員至外周的骨髓干細胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的合成來實現(xiàn)心功能的保護作用。內(nèi)皮型一氧化氮合酶是內(nèi)皮細胞生長和遷移，血管重建和血管生成的重要因子［12］，在缺血早期，內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達增加可以一定程度促進血管生成而增加毛細血管密度、抑制心肌凋亡。

1.2 其他細胞因子作用

除了CXCL12 和CXCR4 相互作用以外，還有其他細胞因子及相關的信號通路作用于整個HSCs 動員、歸巢至心臟的過程［13-14］。如 Wnt 信號通路，Assmus 等［15］表示 MI 誘導了典型Wnt 信號的激活，與HSCs 的擴展和遷移有關。Wnt 通路是復雜的信號蛋白家族，經(jīng)典和非經(jīng)典的啟動途徑受組織微環(huán)境中的大量細胞因子和小分子的影響。非經(jīng)典Wnt 途徑的激活可以在經(jīng)典信號中發(fā)揮抑制作用。急性MI后骨髓內(nèi)Wnt信號傳導的機制尚不清楚，有學者推測是由于兒茶酚胺的激活導致的［15］。

此外，生物活性脂質鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）和神經(jīng)酰胺-1-磷酸（ceramide-1-phosphate，C1P），已在外周血中被鑒定為主要的HSCs 化學引誘物［16-17］，其中S1P 主要通過紅細胞在外周血中轉運，缺血性心肌損傷后先天性免疫系統(tǒng)的激活和全身補體的激活可以促使紅細胞釋放生物活性脂類物質，血漿C1P的主要來源是細胞內(nèi)C1P 釋放或從受損細胞中泄漏［18］。到目前為止，研究人員已經(jīng)鑒定出了S1P（S1P1-5）的5 種受體亞型，S1P1-3 在整個心血管系統(tǒng)和骨髓前體細胞中高度表達。S1P1 作用由 Gi 蛋白、Ras-MAP 激酶、PI3K-AKt、PLC 途徑介導。而S1P2和S1P3受體作用由PLC 途徑和Rho途徑通過多種G 蛋白介導。S1P 與S1P1 或S1P3 結合來介導造血前體細胞的遷移。相反，激活S1P2 則產(chǎn)生負調(diào)節(jié)HSCs 動員的作用。S1P4 和S1P5 受體分別在免疫和神經(jīng)系統(tǒng)中起作用。C1P 同樣可以與多種G 蛋白偶聯(lián)受體相互作用［18］。心臟神經(jīng)生長因子（NGF）過表達能夠促進骨髓來源前體細胞動員至心臟［19］。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）處理過的臍帶血來源CD34+細胞可以增強其在缺氧條件下的生存能力［20］，LPA 主要通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ 誘導CD34+細胞存活，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ的激活可誘導Akt 和ERK 信號傳導途徑的激活和抑制線粒體凋亡途徑（降低BAX 和CASP9的表達）。

1.3 心肌損傷是造血干細胞動員的重要前提

人體內(nèi)大多數(shù)HSCs 處于靜止狀態(tài)，可以在諸如感染等系統(tǒng)性損傷的情況下激活。HSCs 對組織損傷的反應可能與缺血性損傷中患者的長期存活率相關，且HSCs 在組織修復和患者康復中起一定作用［21-24］。有研究顯示，急性MI 后CD34+、CD133+細胞水平顯著增加，在缺血性損傷后7 d 達到頂峰，CD34+細胞的初始動員程度已被證明是急性MI 后更有利于心肌重構的獨立預測因子。此外，急性MI后升高的多種細胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）或粒細胞集落刺激因子（G-CSF），可調(diào)節(jié)造血祖細胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）的增殖［25］。Theiss 等［26］測量了缺血型心肌?。↖CM），擴張型心肌?。―CM）和正常人的心肌中歸巢因子的mRNA 表達水平，與擴張型心肌病和對照心臟相比，缺血型心肌病心臟中CXCL12、肝細胞生長因子、缺氧誘導因子-1a 和血管細胞黏附分子顯著升高（擴張型心肌病和對照心臟顯示相似的表達）。心肌缺血后，各種趨化因子表達增加，可以進一步促進從骨髓中動員出的干細胞歸巢心臟。心肌損傷后膜聯(lián)蛋白-A1（ANX-A1）的表達也會增加，膜聯(lián)蛋白-A1（ANX-A1）是一種糖皮質激素調(diào)節(jié)蛋白5，具有抗炎作用，可以保護心肌免受缺血性損傷、減少梗死面積，動物實驗研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白-A1的缺乏會增加心肌缺血后小鼠梗死面積增加，心肌炎癥反應增強，與之伴隨的是HSCs 的動員增加［27］。

此外，miRNA 是最近研究的熱點，部分miRNA 具有組織特異性表達的特點，如心肌組織中富含miR-208a 和miR-499-5p，而miR-1a 和miR-133a 則在心肌和骨骼肌中均存在高表達。有研究證明，MI 后外周血內(nèi)心肌特異性miRNA（miR-1、miR-208、miR-499）會顯著增高，這些外周循環(huán)內(nèi)的心肌特異性miRNA 大多存在于外泌體內(nèi)被釋放入血［28］。這些包裹心肌特異性miRNA 的外泌體選擇性地遷移至其他組織，且優(yōu)先轉移到骨髓，在骨髓中它們抑制CXCR4 的表達并介導骨髓細胞的動員。

2 造血干細胞應用于心肌梗死的機制研究進展

近些年相繼有臨床實驗使用HSCs 用于治療MI［29-31］。由此引出對HSCs 對應用于MI 的機制探討。

2.1 轉分化機制

有學者認為，HSCs 動員至心臟后可以轉化為心肌細胞。骨髓來源干細胞轉化為心肌細胞是心肌細胞再生研究的重要方向，應用于心肌細胞轉化研究的骨髓來源細胞主要包括兩大類：即HSCs 和間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC），有研究［32-34］證明，HSCs 和 MSCs 都能獲得心肌細胞表型，其中Fukata 等［34］的研究檢測了骨髓細胞在同基因骨髓移植后的心肌形成潛力，以鑒定具有心肌潛能的骨髓來源細胞群，骨髓來源的心肌細胞來源于造血譜系，而其中髓系細胞則是產(chǎn)生心肌細胞的主要中間體。2001 年Orlic 等將骨髓提取的骨髓單個核細胞注射到結扎了冠狀動脈前降支的小鼠MI 心肌區(qū)域內(nèi)，發(fā)現(xiàn)9 d 后其MI 區(qū)域心肌收縮功能改善，因此認為是移植的干細胞轉化成了心肌細胞，而對于HSCs［14］獲得心肌細胞表型的機制，上述研究尚無定論。因此對于對移植HSCs 能否轉化心肌細胞的問題上，應該保持謹慎態(tài)度。

2.2 細胞融合機制

部分學者認為HSCs 動員至心臟后發(fā)揮作用的主要機制是產(chǎn)生了細胞融合的現(xiàn)象。2004 年Balsal 等［35］表明在表達綠色熒光蛋白（green flfluorescent protein，GFP）的轉基因鼠的MI 部位直接注射Ckit+骨髓細胞后并沒有觀察到Orlic 所提到的轉分化現(xiàn)象，雖然移植后10 d 可以在心肌中觀察到大量GFP+細胞，但在30 d 后只有少量的GFP+細胞仍然存留在心肌。而且GFP+細胞沒有表達特異心臟標記物，而表達CD45、髓系標志物Gr-1、淋巴系標志物B220 等造血系統(tǒng)標志物。之后Wu［36］等的研究提出Balsam等的數(shù)據(jù)一定程度低估了心肌受損后循環(huán)細胞的作用，因為其并沒有考慮到MI 后建立穩(wěn)定的共生模型所需時間的因素。若交叉循環(huán)建立的穩(wěn)定少于7 d，那么在MI 小鼠的心臟處骨髓來源細胞的聚集就不夠充分，下一步的轉化過程就無法順利進行。考慮到損傷誘導信號是干細胞活動的重要調(diào)節(jié)因子，只有在損傷早期才會短暫升高，如免疫調(diào)節(jié)劑和趨化因子，Wu 的研究較前者不同之處在于小鼠共生模型交叉循環(huán)穩(wěn)定后（大約7～10 d）再進行手術誘導MI，從而重新評估循環(huán)細胞的作用。兩周后進行分析發(fā)現(xiàn)少部分GFP+細胞分別表達內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞標志物：異凝集素（isolectin）和SM22α，表明循環(huán)細胞參與了微血管的重建。大部分不表達平滑肌細胞標志物的循環(huán)細胞大都表達造血細胞標志物CD45，包括T 系（21.25%±0.05%），B系（39.25%±2.35%），巨噬細胞系（29.9%±1.90%）。此外將MerCreMer（MCM）轉染小鼠與GFP 轉染小鼠做同樣處理并在MI 部位取樣做免疫組化分析發(fā)現(xiàn)GFP+細胞分散在缺血區(qū)域，部分細胞表達了成熟心肌細胞標志物肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）。定量分析顯示缺血區(qū)域GFP 陽性細胞中有9.39%的細胞同時表達Cre（GFP+/Cre+），表明循環(huán)GFP+細胞與原有心肌細胞發(fā)生了融合。同時（GFP+/Cre-）類型細胞占0.17%，提示循環(huán)細胞發(fā)生了轉分化，但比例較低。上述結果表明細胞融合相對轉分化是較為主要的機制。心肌細胞是終末分化的細胞，具有非常有限的增殖能力。細胞融合可以促進心肌細胞重新進入細胞周期［37］，因此，細胞融合在心肌細胞修復中具有潛在的優(yōu)勢。

2.3 旁分泌機制

對于轉分化和細胞融合發(fā)揮的作用，越來越多人保持懷疑態(tài)度，因為大量進入心臟的細胞并不能長期存留。目前學者開始關注HSCs 動員至心臟后通過其旁分泌作用發(fā)揮功能。

有研究表明，移植SCs 的研究沒有表現(xiàn)出永久的移植細胞的定植，但仍然有心功能的改善，且MSCs 的條件培養(yǎng)基具有心臟保護作用，胞外囊泡可能在MSCs 發(fā)揮旁分泌效能中起關鍵作用［38］。HSCs 亦有相似發(fā)現(xiàn)。胞外囊泡包括外泌體（30～100 nm），微泡（100～1 000 nm）和凋亡小體（高達5 000 nm）。MI 后心肌細胞釋放入血的胞外囊泡如外泌體是MI 診斷的潛在標志物，此外，制作包含缺血心肌靶向肽（如IMTP）的胞外囊泡作為細胞治療及藥物治療的載體在MI 的治療中具有很大潛力［39-40］。胞外囊泡中包含有多種具有催化活性的蛋白質以及在細胞間信息傳遞起重要作用的 mRNA 和 miRNA［41］。HSCs 主要產(chǎn)生外泌體和微泡兩種，已發(fā)現(xiàn)HSCs 分泌的外泌體表達幾種抗細胞凋亡和促血管生成因子的mRNA，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），胰島素生長因子-1，堿性纖維母細胞生長因子，和白細胞介素-8［42］。有研究表明，GSF動員的骨髓來源的外泌體含有豐富的microRNA-126（miR-126）能降低血管黏附因子-1（VCAM-1）的表達進而促進HSCs 從骨髓到外周血的動員。而microRNA-126不僅可以作為細胞功能的內(nèi)在調(diào)節(jié)因子，還能作為促進血管形成的旁分泌因子起作用［43］。

2.4 其他可能機制

除上述可能機制以外，有學者認為HSCs 可能促進心外膜細胞發(fā)生上皮間充質轉化從而實現(xiàn)MI 后對心臟的保護作用。在心臟發(fā)育過程中，胎兒心外膜可分泌促進心肌生長的因子，心外膜細胞的一個亞群也經(jīng)歷上皮-間充質轉換，形成心外膜衍生細胞（EPDCs）。心外膜衍生細胞被認為可在心臟正常發(fā)育過程中分化形成心肌和內(nèi)皮細胞，但這一理論仍存在爭議［44］。

Li 等［45］將幼年小鼠Sca-1 陽性（HSC 標志）細胞移植入大齡小鼠體內(nèi)后，可在MI 后發(fā)揮保護心臟功能的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Sca-1 陽性細胞可在MI 后向心外膜歸巢并促使心外膜細胞增殖，并通過轉化生長因子-β信號通路激活上皮間充質轉化［45］。

3 問題和展望

HSCs 應用于MI 的機制研究說法不一，但自體HSCs 用于治療MI 可以避免免疫排斥反應，因此具有很大的應用前景，但仍然存在一些問題，如：（1）細胞移植治療的最佳細胞數(shù)量和濃度、移植方式、移植存活分化的機制；（2）細胞移植的遠期療效及安全性；（3）是否有產(chǎn)生惡性心律失常及惡性腫瘤的可能，是否可能有系統(tǒng)并發(fā)癥；（4）如何提高HSCs 獲取率，完善HSCs 的純化與擴增培養(yǎng)體系［20］。