孫 洋，張 巖

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 阜外醫(yī)院 國家心血管病中心 1.病理科； 2.心外科, 北京 100037)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是致死率極高的常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人們的生命及健康。心肌梗死后如何促進心肌再生為目前亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。心外膜是緊貼在心肌外面的一層疏松結(jié)締組織，為一群具有異質(zhì)性的細(xì)胞群，具有多向分化的潛能，不僅能夠增殖、分化為多種間質(zhì)細(xì)胞，還能夠提供許多調(diào)節(jié)心肌組織修復(fù)的信號分子，因此近十年來，心外膜細(xì)胞已成為心肌再生領(lǐng)域的研究熱點[1]。隨著對心外膜生物學(xué)特性認(rèn)識的深入，越來越多的研究者嘗試?yán)眯耐饽ご龠M心臟修復(fù)。低等脊椎動物心肌細(xì)胞具有較強的再生能力，如斑馬魚的心臟被部分切除或損傷后1～2 d，心外膜即可被廣泛激活，表達胚胎期標(biāo)記(如fn1a、raldh2、tbx18和wt1)，促進心肌完全愈合。幼年哺乳動物的心肌細(xì)胞也具有再生能力，如切除新生小鼠心尖部組織后，創(chuàng)傷能夠快速激活心外膜，促進心肌細(xì)胞增生、修復(fù)，恢復(fù)心室腔的體積[2]。在成年小鼠中，已有研究發(fā)現(xiàn)心臟損傷同樣能夠激活心外膜， 引起胚胎期標(biāo)志物的重新表達，但心外膜在心肌修復(fù)中的作用，不同的研究者持不同觀點?，F(xiàn)就心外膜的特點，及其在心臟修復(fù)中的作用進行綜述，并探討如何利用心外膜的特性提高心臟修復(fù)能力。

1 心外膜細(xì)胞的起源、分化和再生

胚胎期心外膜細(xì)胞來源于一個叫做心外膜器官(proepicardial organ，PEO)的瞬時胚胎細(xì)胞簇。在受精后60～72 h PEO移位并貼附于心肌表面，在心室、心房和流出道(或球狀動脈)表面擴展，相互融合形成心外膜。隨著發(fā)育的進展，一部分心外膜細(xì)胞經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，并遷移到心外膜下空間內(nèi)，分化產(chǎn)生各種類型的細(xì)胞，被統(tǒng)稱為心外膜來源細(xì)胞(epcardium-derived cells,EPDCs)[3]。使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)證明心外膜細(xì)胞是一群具有異質(zhì)性的細(xì)胞亞群，每個亞群均有特定的表達特征以及特異的標(biāo)記基因[4]。

心外膜細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠分化為成纖維細(xì)胞[5]、血管平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，但是目前尚無充分的證據(jù)證明心外膜能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞。使用譜系追蹤技術(shù)研究小鼠心臟發(fā)育發(fā)現(xiàn)，心外膜細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的主要來源[6]。心臟損傷后，心外膜來源的成纖維細(xì)胞廣泛增殖并參與瘢痕組織形成；心外膜細(xì)胞亦能夠分化為梗死區(qū)內(nèi)的血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞[7],并協(xié)助冠脈系統(tǒng)重建；心外膜還能夠分化為脂肪細(xì)胞，替代萎縮消失的心肌細(xì)胞。

心外膜有很強的再生能力。成年心臟損傷后，殘余的心外膜細(xì)胞會發(fā)生增殖并向損傷部位遷移。使用基因燒蝕系統(tǒng)(tcf21:Nitroreductase，tcf21:NTR)將成年斑馬魚中90%的心外膜細(xì)胞燒蝕，心外膜依然能快速再生[8]。對斑馬魚心外膜再生過程進行高分辨率實時成像觀察，發(fā)現(xiàn)在再生組織的前端出現(xiàn)了一個多倍體心外膜細(xì)胞亞群。這些多倍體細(xì)胞是在機械張力作用下，通過非細(xì)胞分裂的基因組復(fù)制而形成。

2 心外膜的信號功能

成年心臟發(fā)生MI后，能夠激活心外膜， 使其增殖、擴散、發(fā)生EMT以及遷移入心肌層。心外膜被激活后，還能夠分泌很多影響心肌再生的信號分子[9]。心外膜來源的細(xì)胞外基質(zhì)成分(extracellular matrix,ECM)和生長因子在維持心臟組織結(jié)構(gòu)和電生理功能方面起重要作用。此外，激活的心外膜可增強炎性反應(yīng)，減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)數(shù)量、激活巨噬細(xì)胞并調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞浸潤[10]。

2.1 心外膜表達的重要信號分子

2.1.1 轉(zhuǎn)化生長因子-β：轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在心血管發(fā)育和疾病中發(fā)揮多重作用，斑馬魚心肌損傷后，心外膜細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和心肌細(xì)胞均廣泛表達TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3。藥物阻斷斑馬魚的TGFβ信號通路能夠抑制ECM沉積和心肌細(xì)胞增殖。

2.1.2 血小板源生長因子： 血小板源生長因子(platelet-derived growth factors，PDGF)信號在體外能夠誘導(dǎo)斑馬魚心外膜細(xì)胞增殖，在體內(nèi)能夠抑制心臟再生過程中冠狀動脈血管形成。在斑馬魚切除損傷模型中，在傷口纖維蛋白凝塊中表達PDGF-β，而在傷口部位的心外膜中表達血小板源性生長因子受體-β(PDGFR-β)。小鼠MI后, 梗死區(qū)表達 PDGF-β、PDGFR-β和PDGFR-α, 梗塞區(qū)血管周細(xì)胞中表達磷酸化活化的PDGFR-β。抗體阻斷PDGFR-α和PDGFR-β，能夠減少膠原蛋白沉積，造成MI區(qū)的修復(fù)能力受損。

2.1.3 胰島素樣生長因子：斑馬魚中，損傷后7 d內(nèi)，成熟的心內(nèi)膜和心外膜細(xì)胞中表達IGF2b配體，心肌細(xì)胞中表達IGF1受體。使用IGF信號激動劑NBI-31772，可以促進心肌細(xì)胞增殖；而抑制IGF信號能夠降低心肌細(xì)胞的增殖和受損的心臟再生。

2.1.4 趨化因子：斑馬魚心肌切除損傷模型中，心外膜組織中表達CXC-趨化因子配體12a(CXCL12a)，心肌中表達CXC-趨化因子受體 4b(CXCR4b)。阻斷CXCR4后破壞了心臟的再生能力，原因可能為心肌細(xì)胞遷移受阻。另外，心肌CXCL12b信號和內(nèi)皮CXCR4a信號在斑馬魚冠狀動脈血管發(fā)育中起著重要作用，CXCR4a突變者心臟再生缺陷。

2.1.5 WNT-β-catenin信號通路：Wnt1在胎兒心外膜中表達，正常成年心外膜不表達[11]。MI后，損傷區(qū)的心外膜和心肌成纖維細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)性表達Wnt1。若在心外膜細(xì)胞中敲除其下游β-catenin將導(dǎo)致心外膜EMT的能力下降；在心臟成纖維細(xì)胞中敲除β-catenin導(dǎo)致急性心臟擴張,心臟功能紊亂。

2.1.6 Hedgehog：Hedgehog參與多個器官、組織的發(fā)育過程,與心臟再生相關(guān)。斑馬魚局部心室切除后7 d，損傷部位心外膜中 Hedgehog配體激活, Hedgehog的靶基因PTCH 2在再生區(qū)的心肌細(xì)胞內(nèi)表達，促進再生過程中心肌細(xì)胞的增殖。Hedgehog還可調(diào)節(jié)心外膜細(xì)胞再生。在哺乳動物心臟發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中，Hedgehog信號可能是缺血性心臟病的一個潛在治療靶點。

2.1.7 Hippo-YAP信號通路：Hippo-YAP信號通路能夠調(diào)節(jié)哺乳動物的心肌細(xì)胞增殖，即使是在成年期YAP1的表達及其結(jié)合靶基因的能力也會對心肌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生顯著影響[12]。在小鼠心臟發(fā)育過程中，Hippo-YAP信號通路中的許多信號分子 (YAP、Taz、Tead1-Tead3、Lats1、Lats2)在心外膜中表達，心外膜中YAP1、Taz是冠狀動脈血管發(fā)育所必需的。敲減胚胎期小鼠心外膜中Lats1和Lats2，能夠減少心外膜-成纖維細(xì)胞分化。在小鼠心外膜中敲除Yap和Taz可引起深部心包炎、心肌纖維化、心肌病和MI。

其他心外膜表達的信號分子，如胸腺素β4、小窩蛋白caveolin 1、神經(jīng)調(diào)節(jié)因子1 (neuregulin 1，Nrg1)、成纖維細(xì)胞生長因子、骨形成蛋白(BMP)、視網(wǎng)膜醛脫氫酶2 (Raldh2)以及Notch等也參與心臟修復(fù)。他們功能多樣，在心臟修復(fù)中，相同的信號分子在小鼠和斑馬魚之間的作用存在差異。如心肌損傷后，在斑馬魚中抑制BMP信號，心肌細(xì)胞增殖減少，而在小鼠中抑制BMP信號，心肌細(xì)胞凋亡減少。這些信號分子在人類心臟如何作用還有待研究。

2.2 心外膜在ECM形成中的作用

ECM為其周圍細(xì)胞提供化學(xué)信號和機械支撐，越來越多的證據(jù)表明，心外膜影響ECM重構(gòu)，同樣ECM也影響心外膜細(xì)胞的功能[13]。在心肌修復(fù)過程中，心外膜來源的ECM除了為細(xì)胞提供支架外，還促進細(xì)胞增殖和成熟。例如, 在斑馬魚中，心臟損傷后心外膜細(xì)胞表達ECM中的重要成分FN1和FN1b基因，若FN1基因突變或無表達會干擾心臟再生，導(dǎo)致瘢痕形成。在蠑螈心臟切除-再生模型中，心外膜細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ECM (纖連蛋白、透明質(zhì)酸和替那霉素C)在損傷部位沉積[14]。在鼠心臟發(fā)育過程中,抑制ECM中的重要成分α4-整合素信號能夠刺激心外膜細(xì)胞發(fā)生EMT并分化。盡管這些過程背后的機制還需要進一步澄清，但可以肯定的是心外膜有助于建立支持心臟再生的ECM環(huán)境。

3 心外膜在MI后心肌修復(fù)治療中可能的應(yīng)用

3.1 調(diào)控心外膜

3.1.1 激活心外膜：第一項針對心外膜的嘗試性治療是在小鼠中使用再生因子胸腺素β4通過改變?nèi)旧|(zhì)激活心外膜[15]，刺激EPDCs增生并多向分化為成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進毛細(xì)血管增生，擴大血管床面積，改善心肌組織血供。之后，研究者們也不斷嘗試其他方法，如使用前動力蛋白1(prokineticin 1，POK1)、VEGFA或基因調(diào)控的方法增加修復(fù)因子分泌或刺激產(chǎn)生有益的ECM成分，或者使用多種手段相結(jié)合，輔以病毒載體使藥物更容易地進入心外膜，促進心肌再生[16]。然而心肌細(xì)胞的再生能力有限，MI后受損的心肌只能由瘢痕增生替代，心臟功能降低迅速，目前這些方法還并不是特別有效。

3.1.2 調(diào)控心外膜分化：開發(fā)了一種從人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)中產(chǎn)生功能性心外膜樣細(xì)胞的方法，通過控制BMP和WNT的劑量來調(diào)控人類iPSCs的心血管譜系分化。后續(xù)研究中，iPSCs誘導(dǎo)分化的心外膜細(xì)胞能夠發(fā)生EMT，并能分化為平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[17]。用BMP4和RA促進人類胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)和人類iPSCs分化，將其接種到小雞胚胎宿主上時，產(chǎn)生的心外膜樣細(xì)胞具有黏附性，并能在心肌表面擴散[18]。這些研究為移植心外膜細(xì)胞和心外膜來源譜系用于治療心臟病提供了可能性。雖然研究者們做了多種嘗試，但是誘導(dǎo)人類心外膜細(xì)胞增殖和分化的實驗還存在技術(shù)上的挑戰(zhàn)。

3.2 心外膜補片

心外膜補片移植是MI后心肌再生治療良好的給藥途徑，效率比直接肌肉注射或血管內(nèi)灌注更好。一類補片直接在支架材料上結(jié)合種子細(xì)胞(干細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞)或藥物，如結(jié)合心肌基質(zhì)細(xì)胞的微針孔補片[19]、結(jié)合間質(zhì)干細(xì)胞的補片[20]和離子交聯(lián)透明水凝膠制成的黏彈性補片[21]。另一類補片則嘗試模擬心外膜成分或激活心外膜。在小鼠中應(yīng)用生物工程技術(shù)設(shè)計制作的類似胚胎期心外膜的補片能夠刺激心肌細(xì)胞增殖、縮小梗死面積、改善心肌功能[22]。該研究發(fā)現(xiàn)，將心外膜間皮細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞來源的未成熟心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，能夠提高心肌細(xì)胞增殖能力，其主要活性因子為分泌糖蛋白FSTL1。FSTL1參與抑制炎性反應(yīng)、降低心肌細(xì)胞凋亡、促進心肌纖維細(xì)胞活化和MI后的心肌保護。在一項小型豬研究中也觀察到類似的效果。在損傷后應(yīng)用心外膜補片，1周后即可觀察到修復(fù)效果，這對MI確診后使用患者特異性補片的治療具有指導(dǎo)性意義。作者在兔心肌梗死動物模型中，使用添加了TGF-β等藥物的載藥薄膜補片，使用緩釋藥物刺激心外膜反應(yīng)，亦觀察到實驗組心肌梗死面積較對照組小，心肌內(nèi)毛細(xì)血管密度增高。

4 問題與展望

人類心臟損傷的再生性治療是一個巨大的挑戰(zhàn)，雖然心外膜細(xì)胞不能直接發(fā)育成心肌細(xì)胞，但可以通過分化成脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞，并分泌多種信號分子，促進心肌細(xì)胞再生。通過激活心外膜和EPDCs，獲得心外膜對再生功能的支持，可能成為治療的新方向。為了達到這一目標(biāo)，還需要篩選更多、更有效的心外膜和心肌細(xì)胞激活物。此外，為了能夠使用生物工程的方法精確操控心外膜細(xì)胞分化，需要更敏感、更特異的標(biāo)志物識別不同細(xì)胞亞群，并需要對載體進行優(yōu)化，以期最終實現(xiàn)藥物開發(fā)、治療性細(xì)胞移植等目標(biāo)。