韓 涌，王 濤，張 震，劉文偉

（1.烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊 830091）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科A 型流感病毒，根據(jù)其粒子表面抗原血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同，可分為不同亞型。目前已發(fā)現(xiàn)有18 種HA 亞型和11種NA 亞型[1]，其中H1—H16、N1—N9 各亞型流感病毒均可在禽類中分離到，而其他亞型毒株來(lái)源于蝙蝠[2]。根據(jù)病毒致病性不同，可將AIV 分為高致病性、低致病性和無(wú)致病性[3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將高致病性禽流感列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[4]。

H9N2亞型禽流感1994年首次暴發(fā)于廣東省，后逐漸擴(kuò)散至我國(guó)其他區(qū)域，并成為我國(guó)家禽中流行的主要亞型[5-6]。AIV 還可感染包括犬、貓[7]、豬[8]和雪貂[9]在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物。1998年，我國(guó)報(bào)道了首例人H9N2 亞型禽流感病例[10]；1997年5月，我國(guó)香港首次報(bào)道發(fā)生了H5N1 亞型AIV 傳染人并引起死亡的事件[11]。因此，AIV 嚴(yán)重影響了全世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，并對(duì)人類健康構(gòu)成了威脅。

研究[12]表明，活禽交易市場(chǎng)是AIV 向外傳播的主要來(lái)源地。烏魯木齊市活禽交易市場(chǎng)禽類交易頻繁，活禽來(lái)源較為分散，本地活禽交易量較??；市場(chǎng)內(nèi)活禽種類繁多，且長(zhǎng)期密切接觸；市場(chǎng)環(huán)境高濕，環(huán)境消毒不及時(shí)、不徹底。這些都為病毒傳播提供了有利條件[13]，也導(dǎo)致交易市場(chǎng)成為AIV跨物種傳播的重要環(huán)節(jié)[14-15]。冬季是禽流感高發(fā)季節(jié)。為了解冬季新疆烏魯木齊市活禽市場(chǎng)交易活禽的AIV 感染情況，以便采取措施降低AIV 通過(guò)活禽交易市場(chǎng)向外傳播以及感染人的風(fēng)險(xiǎn)，2019年11月至2020年1月開(kāi)展了本次調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 柱式RNA 核酸提取試劑盒（批號(hào)YRNA-TQ 20190926P）、AIV 通用型熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)AIV20191018P），均由哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司提供；H5、H7 和H9 亞型AIV 三重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)60050），深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司提供；AI-H5（Re11）株抗原（批號(hào)20191012）、陽(yáng)性血清（批號(hào)20191011）、AI-H5（Re12）株抗原（批號(hào)20190828）、陽(yáng)性血清（批號(hào)20190925）；AI-H7（Re2）株抗原（批 號(hào)201900416）、陽(yáng)性血清（批號(hào)20180901）、陰性血清（批號(hào)20180426），均購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)3K15），購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)QuantStudio 5），購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；電熱式恒溫水浴鍋（型號(hào)DM0421），購(gòu)自北京市醫(yī)療設(shè)備有限公司；可調(diào)式漩渦振蕩器（型號(hào)MX-S），購(gòu)自大龍器械有限公司；瞬時(shí)離心機(jī)（型號(hào)MinX-5），購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。

1.1.3 樣本 血清樣本：用2.5 mL 一次性采血器采集2 mL 全血，一一對(duì)應(yīng)編號(hào)，放至室溫自然析出血清，用1.5 mL 離心管收集淡黃色清亮血清，共采集85 份血清樣本。棉拭子樣本：采集交易活禽的泄殖腔/咽喉棉拭子（103 份）和2 個(gè)大型活禽運(yùn)輸車(chē)輛出入通道環(huán)境拭子（40 份），共143份。將采集的樣本放入裝有冰袋的采樣箱內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。本次調(diào)查所采集的樣品于2019年11月至2020年1月分3 次采集，具體信息見(jiàn)表1。

表1 血清樣品來(lái)源及采集時(shí)間

1.2 方法

1.2.1 免疫抗體檢測(cè) 按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18936—2003 中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)方法，分別檢測(cè)活禽血清樣本的H5（Re-11）、H5（Re-12）、H7（Re-2）AIV 抗體?？贵w效價(jià)≥log24為免疫免疫抗體合格。

1.2.2 核酸檢測(cè)

1.2.2.1 樣品滅活 將采集的棉拭子樣品放入恒溫水浴鍋中56 ℃ 30 min 滅活。

1.2.2.2 核酸提取 將水浴鍋中的棉拭子取出，置于振蕩器充分震蕩；參照柱式RNA 核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA 核酸提取，將提取后的核酸放至-20 ℃保存待檢測(cè)。

1.2.2.3 核酸檢測(cè) 將提取的RNA 核酸，參照AIV 通用型熒光定量RT-PCR 檢測(cè)劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.4 核酸分型 將通用型AIV 核酸檢測(cè)為陽(yáng)性的核酸，參照H5、H7 和H9 亞型AIV 三重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分型，對(duì)陰性樣品定義為未分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫抗體檢測(cè)

85 份活禽血清樣本中，H5（Re-11）株免疫抗體合格50 份，合格率為58.8%；H5（Re-12）株免疫抗體合格52 份，合格率為61.2%；H7（Re-2）株免疫抗體合格54 份，合格率為63.5%。由圖1 可以看出，市場(chǎng)交易活禽流感免疫抗體水平普遍不高，低于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的70%的最低標(biāo)準(zhǔn)，抗體效價(jià)大部分低于log24，且免疫抗體合格樣品效價(jià)也臨近臨界值，效價(jià)點(diǎn)密集分布在 log23～log25之間。

圖1 85 份血清樣品的禽流感免疫抗體效價(jià)分布

2.2 病毒核酸檢測(cè)

2.2.1 活禽棉拭子核酸檢測(cè) 在采集的雞、鴨、鵝、鴿4 種禽類103 份活禽泄殖腔/咽喉棉拭子中，檢出AIV 核酸陽(yáng)性29 份，陽(yáng)性率為28.15%。各種禽類樣品的檢測(cè)結(jié)果及PCR 檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)表2、圖2。從表2 可以看出，鵝和鴨陽(yáng)性率較高，雞和鴿子較低，說(shuō)明水禽的AIV 感染率較高。該結(jié)果符合禽流感的流行病學(xué)特征。從圖2 可以看出，活禽棉拭子核酸陽(yáng)性較強(qiáng)，出現(xiàn)S 形曲線的Ct 值較小，熒光信號(hào)出現(xiàn)較早，表明樣品質(zhì)量能夠滿足試驗(yàn)要求。

表2 活禽泄殖腔/咽喉棉拭子AIV 核酸檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 外環(huán)境AIV 核酸檢測(cè) 在2 個(gè)開(kāi)放通道采集的40 份環(huán)境棉拭子中，檢出AIV 核酸陽(yáng)性7 份，陽(yáng)性率為17.5%。PCR 陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。這說(shuō)明2 個(gè)開(kāi)放式通道雖然通風(fēng)效果較好，但依然存在AIV 污染。

圖2 活禽泄殖腔/咽喉棉拭子AIV 核酸熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖3 活禽交易區(qū)外環(huán)境AIV 核酸熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.3 核酸分型

36 份AIV 核酸陽(yáng)性樣品，經(jīng)H5、H7 和H9亞型三重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測(cè)，檢出H5 亞型3份，陽(yáng)性率為8.33%；H9 亞型22 份，陽(yáng)性率為61.11%；未定型11 份，陽(yáng)性率為30.56%。具體結(jié)果詳見(jiàn)表2、圖4～5。從表2 可以看出，活禽市場(chǎng)內(nèi)的交易活禽以感染H9 亞型AIV 為主，占比61.11%；H5 亞型次之，占比8.33%，H7 亞型最低，為0。從活禽種類來(lái)看，鴨、鵝等水禽以感染H9亞型AIV 為主。市場(chǎng)通道環(huán)境中，未檢出H5、H7和H9 亞型病毒。

3 討論

3.1 交易活禽流感免疫抗體情況

H5、H7 亞型禽流感屬于國(guó)家強(qiáng)制免疫的重大動(dòng)物疫病，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的整體免疫抗體合格率需≥70%，免疫密度≥95%。2019年下半年開(kāi)始，烏魯木齊市用新的H5（Re-11、Re-12）+H7（Re-2）三價(jià)苗進(jìn)行強(qiáng)制免疫。但從此次調(diào)查結(jié)果來(lái)看，交易活禽的免疫抗體水平普遍較低。其原因可能有以下兩點(diǎn)：一是養(yǎng)殖場(chǎng)戶忽視對(duì)即將進(jìn)入交易環(huán)節(jié)活禽的H5、H7 亞型禽流感免疫；二是部分養(yǎng)殖戶仍使用庫(kù)存的未更新毒株的禽流感疫苗免疫，而此次檢測(cè)的是新毒株疫苗的免疫抗體。

表3 不同類型樣本禽流感病毒核酸分型情況比較

圖4 H5 亞型AIV 核酸熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖5 H9 亞型AIV 核酸熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

3.2 交易市場(chǎng)內(nèi)部活禽AIV 污染狀況

對(duì)不同禽類的AIV 核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，鴨和鵝等水禽的陽(yáng)性率較高，而雞最低，這與鴨和鵝等水禽是AIV 自然宿主這一結(jié)論一致[16]，也提示活禽市場(chǎng)需加強(qiáng)對(duì)水禽的禽流感防控[17]。AIV 各亞型核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，H5 亞型陽(yáng)性率為8.33%，H9 亞型為61.11%，未檢出H7 亞型，這與目前流行于我國(guó)的AIV 主要是H5 和H9 亞型的結(jié)論一致[18-19]。

3.3 交易市場(chǎng)內(nèi)部活禽管理情況

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該活禽市場(chǎng)環(huán)境濕度較高，活禽來(lái)源分散，存放密度較大，這為病毒傳播提供了有利條件。此外，各檔口存留活禽仍放在市場(chǎng)交易區(qū)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)活禽“零過(guò)夜”。這將造成病毒在環(huán)境中持續(xù)存在，從而為病毒重配產(chǎn)生新的病毒亞型提供了條件。

據(jù)調(diào)查[20]，活禽交易市場(chǎng)內(nèi)活禽運(yùn)輸車(chē)、活禽檔口以及活禽屠宰點(diǎn)3 個(gè)主要環(huán)節(jié)AIV 核酸污染狀況較嚴(yán)重，是市場(chǎng)防控AIV 流行的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)。結(jié)合本次調(diào)查的進(jìn)入市場(chǎng)活禽H5、H7 免疫抗體水平低而H5、H9 亞型禽流感污染狀況較嚴(yán)重，提示應(yīng)做好以下工作：加大活禽交易市場(chǎng)監(jiān)管力度，每天清洗消毒，包括市場(chǎng)內(nèi)和進(jìn)出市場(chǎng)的通道，堅(jiān)持“一日一清洗、一周一消毒、一周一休市、活禽零過(guò)夜”的市場(chǎng)管理制度；重點(diǎn)加強(qiáng)水禽監(jiān)測(cè)，杜絕水禽和陸禽混合交易；在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，加強(qiáng)禽流感免疫，提高禽流感的免疫保護(hù)水平。

4 結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該交易市場(chǎng)交易活禽和對(duì)外通道中都存在比較嚴(yán)重H9 和H5 亞型AIV 污染，且交易活禽H5、H7 禽流感免疫抗體水平較低，已不能起到有效的保護(hù)作用，因而需要通過(guò)加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管和清洗消毒，來(lái)降低市場(chǎng)內(nèi)禽流感疫情的暴發(fā)和散播風(fēng)險(xiǎn)。