（玉林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西玉林 537000）

鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus，DuCV）屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，病毒粒子無(wú)囊膜，呈二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑約15 nm，核酸為單股環(huán)型DNA，是目前已知最小的鴨病毒。Hattermann 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，DuCV 感染造成的淋巴組織損傷導(dǎo)致了機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫功能的下降，這種免疫抑制反應(yīng)增強(qiáng)了其他共感染因素的致病性。施少華等[2]研究發(fā)現(xiàn)，大部分品種及不同日齡的鴨對(duì)DuCV 均易感。2014年粟艷瓊[3]等發(fā)現(xiàn)，廣西家禽市場(chǎng)健康鴨群的DuCV 平均檢出率為8.01%，其中玉林市為1.36%。2016年楊晶[4]等對(duì)我國(guó)部分地區(qū)采集的302 份鴨組織樣品，進(jìn)行了7 種常見(jiàn)鴨病毒性疫病檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DuCV 檢出率高達(dá)20.2%，說(shuō)明DuCV 已成為我國(guó)鴨群中的主要流行病原之一。

玉林市養(yǎng)殖信息報(bào)送系統(tǒng)提供的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，玉林市2016—2019年鴨平均存欄量為1 170.73 萬(wàn)只，且鴨養(yǎng)殖規(guī)模逐年增長(zhǎng)，已成為廣西重要的鴨養(yǎng)殖基地。DuCV 常呈隱性和混合感染，感染后的臨床癥狀不典型，需要輔助以分子生物學(xué)方法進(jìn)行確診[5]。為初步了解玉林市DuCV 感染情況，對(duì)2016—2019年部分養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢的病死鴨組織樣品，通過(guò)PCR 方法進(jìn)行病原檢測(cè)，以期為玉林市DuCV 感染防控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病料樣品

2016—2019年廣西玉林市629 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢的病死麻鴨、櫻桃鴨、白鴨、鬼頭鴨的肺臟、胰腺、脾臟、肝臟、腦組織樣品共856 份。其中，2016年137 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢168 份，2017年127 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢189 份，2018年146 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢196 份，2019年219 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢303 份（表1）。

1.2 試劑與儀器

核酸自動(dòng)抽提試劑盒：購(gòu)于天根公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒：購(gòu)自TaKaRa 公司；瓊脂糖：BIOWEST 公司產(chǎn)品；DL 2 000 DNA Marker：購(gòu)自TaKaRa 公司。核酸凝膠成像儀：型號(hào)BioDocit 220，UVP 公司產(chǎn)品。高速冷凍離心機(jī)：型號(hào)CT15RT，上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

表1 2016—2019年廣西玉林市養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢情況

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)1 對(duì)DuCV 引物：上游引物5'-GTCGCTGGGAGGAAGAGC-3'；下游引物5'-GTAATACTTGTTTTCGGCGGG-3'。擴(kuò)增片段大小為351 bp。引物均由InvitrogenTM公司合成。

1.4 PCR 擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：模板產(chǎn)物3 μL，上下游引物（20 mmol/L）各0.25 μL，2×PCR Master MiX 12.5 μL，ddH2O 9 μL。擴(kuò)增程序[6]：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后再經(jīng)72 ℃延伸10 min 后，于4 ℃結(jié)束反應(yīng)。取5 μL PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂凝膠上進(jìn)行核酸電泳，在陰、陽(yáng)性對(duì)照均成立的情況下，于核酸凝膠成像儀中觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.5 其他細(xì)菌及病毒檢測(cè)

無(wú)菌采集病死鴨肝臟、肺臟、脾臟、胰腺組織分裝，以無(wú)菌PBS 緩沖液，按質(zhì)量比1:5 稀釋后研磨，用高速冷凍離心機(jī)12 000 r/min離心5 min后，提取200 μL 上清液，使用核酸自動(dòng)抽提試劑盒，按步驟抽提核酸。根據(jù)參考文獻(xiàn)[8-13]中的PCR/RT-PCR 檢測(cè)方法，分別進(jìn)行副黏病毒、禽多殺性巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、鴨黃病毒、大腸桿菌、鴨細(xì)小病毒等6 種病原的核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 總體情況

2016—2018年，856 份病死鴨樣品中，共檢出DuCV 陽(yáng)性91 份，平均檢出率為10.63%。2016年檢出率為2.38%，2018年上升至16.33%，2019年又下降至14.52%（表2）。玉林市所有7 個(gè)管轄縣（市、區(qū)）、所有品種鴨均有陽(yáng)性樣品被檢出，其中不同縣（市、區(qū)）的陽(yáng)性檢出率介于9.89%～20.88%，不同品種鴨的檢出率介于8.79%～28.57%。

表2 2016—2019年廣西玉林市病死鴨DuCV 檢出情況

2.2 不同日齡

不同日齡的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示：1～20日齡的DuCV 檢出率最低，為8.67%；21～65日齡檢出率最高，為15.11%。

表3 各日齡段病死鴨DuCV 檢出情況統(tǒng)計(jì)

2.3 不同月份

不同月份的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示：上年12月—2月、3—5月的DuCV 檢出率較高，分別為11.88%、13.15%；而6—8月、9—11月較低，分別為4.35%、8.56%。

2.4 混合感染

對(duì)91 份DuCV 陽(yáng)性樣品進(jìn)行細(xì)菌及其他病毒的核酸檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有87 份存在混合感染，占比為95.60%（87/91）?；旌细腥揪荄uCV 分別與禽多殺性巴氏桿菌、副黏病毒、鴨疫里默氏桿菌的雙重感染，檢出率分別為47.13%（41/87）、28.74%（25/87）、24.14%（21/87）。

表4 不同月份病死鴨DuCV 檢出情況統(tǒng)計(jì)

3 分析與討論

3.1 流行形勢(shì)

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，廣西玉林市鴨場(chǎng)送檢的病死鴨樣品DuCV 檢出率為10.63%，說(shuō)明該地存在一定水平的DuCV 流行，這與施少華[2]等檢測(cè)的我國(guó)部分地區(qū)病死鴨15.28%的DuCV 個(gè)體陽(yáng)性率基本相符。不同地區(qū)、不同品種鴨均有陽(yáng)性樣品被檢出，說(shuō)明玉林市的DuCV 流行范圍較廣，對(duì)鴨養(yǎng)殖業(yè)影響較嚴(yán)重。因?yàn)楸敬螜z測(cè)的是病死鴨，所以相比粟艷瓊[3]等對(duì)當(dāng)?shù)亟】跌咲uCV 的個(gè)體陽(yáng)性檢出率1.36%有所偏高。從不同年份的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，玉林市DuCV 感染率整體呈上升趨勢(shì)，2017年DuCV 檢出率較2016年上升了3.44%，2018年較2017年上升10.51%。雖然2019年較2018年下降了1.81%，但由于病死鴨檢測(cè)數(shù)量有限，且未對(duì)健康鴨帶毒情況進(jìn)行研究，暫不能說(shuō)明DuCV 感染得到了控制，仍需加強(qiáng)防控。

3.2 感染日齡及易發(fā)季節(jié)

從不同日齡的陽(yáng)性檢出率可以發(fā)現(xiàn)，雖然各年齡段的鴨中都有DuCV 檢出，但21日齡以上病死鴨的檢出率（14.25%）高于20日齡以內(nèi)（7.76%），這可能與該病毒能夠被鴨隱性攜帶有關(guān)。本次檢測(cè)結(jié)果與施少華等[2]的病死鴨DuCV 檢測(cè)結(jié)果基本相符。不同月份統(tǒng)計(jì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，上年12月—2月和3—5月的DuCV 陽(yáng)性檢出率較高，說(shuō)明玉林市DuCV流行有一定的季節(jié)性特征，春冬季節(jié)高發(fā)，這可能與當(dāng)?shù)卮杭镜摹盎啬咸臁睔夂蚝投緶囟润E降過(guò)快有關(guān)。這與楊晶等[4]在我國(guó)部分地區(qū)鴨病毒性疫病流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的DuCV 季節(jié)性特征相似。

3.3 混合感染

本研究發(fā)現(xiàn)，DuCV 與禽多殺性巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、副黏病毒的混合感染比例較高（95.60%），與施少華[2]和黃瑜[7]對(duì)DuCV 與鴨疫里默氏桿菌混合感染研究數(shù)據(jù)相似，驗(yàn)證了Hattermann 等[1]的研究結(jié)論——DuCV 能夠破壞鴨的免疫器官，易繼發(fā)細(xì)菌和其他病毒的感染。

4 結(jié)論

廣西玉林地區(qū)養(yǎng)鴨場(chǎng)中廣泛存在DuCV流行，各日齡段的鴨均有感染；本病具有一定的季節(jié)性特征，以春、冬兩季檢出率較高；DuCV 易與其他病毒和細(xì)菌發(fā)生混合感染。因此，需要在春冬高發(fā)季節(jié)，采取綜合防控措施，加強(qiáng)DuCV 感染以及與其他病原混合感染的控制。