姜?jiǎng)潘?李精敏 李琦

山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院，山西 運(yùn)城 044000

骨質(zhì)疏松性骨折是一種臨床上常見(jiàn)的疾病，給患者和家庭帶來(lái)嚴(yán)重的影響；及時(shí)、可靠的骨折愈合對(duì)于改善骨質(zhì)疏松患者的早期活動(dòng)能力、降低骨折復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、減輕由此給患者和醫(yī)療系統(tǒng)帶來(lái)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)等負(fù)擔(dān)至關(guān)重要[1]。在這些患者中，由于術(shù)后并發(fā)癥、內(nèi)植物失敗和醫(yī)學(xué)合并癥的高風(fēng)險(xiǎn)，骨折愈合過(guò)程往往是漫長(zhǎng)而復(fù)雜的。即便骨折可以愈合，由于骨質(zhì)疏松狀態(tài)的影響和骨修復(fù)能力變差，達(dá)到愈合的時(shí)間可能更長(zhǎng)[2-3]。在骨折愈合過(guò)程中，當(dāng)富含軟骨細(xì)胞的軟骨痂轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓晒羌?xì)胞的礦化基質(zhì)時(shí)，Wnt信號(hào)達(dá)到高峰；因此，通過(guò)促進(jìn)Wnt通路的上調(diào)提供一種促進(jìn)骨折愈合的策略。鋰是GSK-3β抑制劑，在典型的Wnt通路中能促進(jìn)β-catenin的表達(dá)[4]。鋰可以促進(jìn)骨合成代謝作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖[5-6]。但是關(guān)于鋰是否能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折愈合的研究，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究的目的是評(píng)價(jià)鋰在骨質(zhì)疏松性骨折早期愈合中的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

20只24月齡Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠購(gòu)買至上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。大鼠飼養(yǎng)在溫度受控的室內(nèi)(25 ℃)，恒定濕度(40%～50%)并可以自由進(jìn)行飲食。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成治療組和對(duì)照組，每組10只。

1.2 模型建立和治療

在全麻下制作右側(cè)股骨干中段骨折模型。通過(guò)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(1%，0.4 mL/100 g，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)麻醉大鼠，待麻醉滿意后然后將大鼠放置并固定在一個(gè)位置，剃除右大腿毛發(fā)并消毒。通過(guò)股骨外側(cè)制作1.0 cm切口，剝離肌肉后暴露股骨干，使用線鋸(RA-II，7.2 V，Kangyu Medical Instruments Co.，Ltd.，Guangzhou，China)在股骨干中段制作股骨干骨折模型。將經(jīng)過(guò)消毒的克氏針(?1 mm，Jinhuan Medical Products Co.，Ltd.，Shanghai，China)從股骨遠(yuǎn)端髓腔插入并到達(dá)股骨近端。生理鹽水沖洗骨折部位后，逐層縫合筋膜和皮膚。隨后治療組每日給予氯化鋰200 mg/kg灌胃進(jìn)行干預(yù)[7]，對(duì)照組給予同樣的生理鹽水處理。

1.3 樣品獲得和相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

大鼠股骨骨折模型建立后4周，經(jīng)腹主動(dòng)脈抽血并過(guò)量麻醉后行安樂(lè)死,所有大鼠在安樂(lè)死前禁食8 h。取下右側(cè)股骨后對(duì)表面軟組織和肌肉進(jìn)行清理。股骨使用Micro-CT掃描，生物力學(xué)測(cè)試用于評(píng)估骨折愈合情況。其余的股骨保存在中性緩沖甲醛(10 %，pH 7.4)中進(jìn)行組織學(xué)檢查。

骨折愈合情況使用錐形束型臺(tái)式Micro-CT(Micro-CT40，Scanco Medical AG，Bassersdorf，Switzerland)掃描分析，獲得各向同性體素尺寸為10.5 μm(70 kV，114 μA)180個(gè)投影。使用具有協(xié)議(sigma=1.0和support=1.0)的三維高斯濾波器抑制灰度圖像的噪聲。使用已建立的方案將新形成的骨痂組織與舊皮質(zhì)區(qū)分開(kāi)(較低衰減=165和較高衰減=368)。密度最高的組織代表高度礦化的新骨痂組織，而低密度組織代表新形成的骨痂組織。獲得骨折部位上下5 mm(共486個(gè)切片)區(qū)域作為感興趣區(qū)域(ROI)。使用手動(dòng)繪制的輪廓在二維(2-D)CT圖像上選擇ROI。使用制造商軟件計(jì)算骨量/總體積百分比(BV/TV，%)、小梁厚度(Tb.Th，mm)、小梁數(shù)(Tb.N，1 / mm)、小梁分離(Tb.Sp，mm)和骨小梁骨密度(mg HA /cm)。多平面重組用于獲得三維圖像。骨密度(bone mineral density,BMD)閾值(211 mg/cm3)將礦化組織與周圍物質(zhì)分離。

待Micro-CT檢測(cè)后取出克氏針，雙側(cè)固定。運(yùn)用最大載荷為225 N的試驗(yàn)機(jī)(BOSE 3520-AT，Eden Prairie，MN)和內(nèi)置軟件通過(guò)三種彎曲試驗(yàn)來(lái)評(píng)估生物力學(xué)性能。大鼠股骨水平放置在機(jī)器的固定裝置(23 mm跨度)上。以2 mm/min的速度壓迫骨折中心部位直至骨折。測(cè)量的參數(shù)包括最大載荷，剛度(由應(yīng)力-應(yīng)變曲線的斜率得到)和楊氏模量。

用4 %多聚甲醛PBS(pH 7.27.4)溶液固定標(biāo)本，于4 ℃下脫鈣8周，在分級(jí)乙醇和石蠟包埋中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)脫水處理。從截骨部位切取矢狀面5 μm切片(MicromHM 360，Waldorf，德國(guó))，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。在光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯，B2021T-PHD-J11)下，使用附在顯微鏡上的AxiocamICc3數(shù)碼相機(jī)(CarlZeiss)獲取組織學(xué)圖像，并用內(nèi)置軟件進(jìn)行處理。

治療結(jié)束時(shí)處死大鼠，獲取血清樣本，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定各組動(dòng)物的血清Ⅰ型膠原氨基端延長(zhǎng)肽(P1NP)和β-I型膠原羧基端肽(CTX)水平。CTX-I是骨吸收的生物標(biāo)志物，P1NP作為骨形成的生物標(biāo)志物，用商品化試劑盒(Cusabio，中國(guó)武漢；CTX的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為<7%和<8%；批內(nèi)精密度：CV<6%；批間精密度：CV <7%)定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 19.0進(jìn)行，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較各組大鼠血清指標(biāo)。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)各組參數(shù)進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)比較各組的組織學(xué)參數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義設(shè)定在P<0.05的水平。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況

在實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)有動(dòng)物死亡，治療期間未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物有明顯異常和切口感染，所有大鼠均完成4周的治療。

2.2 Micro-CT分析

圖1顯示了兩組的三維重建圖像。骨折周圍骨組織的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)顯示，治療組在4周時(shí)有明顯的、更多的骨痂形成，治療組4周時(shí)BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D及BV、TV密度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，Tb.Sp顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 Micro-CT三維重建觀察骨折愈合情況及檢測(cè)的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù) A:骨折部位三維重建結(jié)果；B:BV/TV；C:Tb.Th；D:Tb.N；E:Conn.D；F:Tb.Sp；G:BV密度；H:TV密度。注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。Fig.1 Micro-CT three-dimensional reconstruction to observe fracture healing and detect microstructure parameters A:three-dimensional reconstruction results of fracture site;B:BV/TV;C:Tb.Th;D:Tb.N;E:Conn.D;F:Tb.Sp;G:BV density;H:TV density.

2.3 組織學(xué)研究

術(shù)后4周時(shí)，治療組骨折部位周圍組織切片的圖像顯示出更多軟骨內(nèi)骨化，還能觀察到一定量的皮質(zhì)骨連接。然而，對(duì)照組的骨痂組織主要由纖維軟骨組成，并且觀察到較少稀疏分布的編織骨或皮質(zhì)的重建。見(jiàn)圖2。

圖2 治療4周時(shí)股骨骨折部位的H&E染色切片 A:對(duì)照組；B:治療組。Fig.2 H&E stained sections of the femoral fracture at 4 weeks of treatment A:control group;B:treatment group.

2.4 生物力學(xué)結(jié)果

術(shù)后4周時(shí)，治療組的極限負(fù)荷顯著高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，能量參數(shù)顯示治療組顯著增加。就剛度而言，與對(duì)照組相比，治療組有明顯改善。此外，治療組顯示出比對(duì)照組更高的彈性模量。見(jiàn)圖3。

圖3 治療4周對(duì)骨折部位生物力學(xué)的影響 A:最大載荷;B:彈性模量;C:剛度。注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。Fig.3 Effect of 4 weeks of treatment on biomechanics of fracture site A:ultimate load;B:elastic modulus;C:stiffness.

2.5 骨代謝指標(biāo)比較

與對(duì)照組相比，在治療組中觀察到骨吸收標(biāo)志物(CTX)和骨形成標(biāo)志物(PINP)的血清水平顯著改變。老年大鼠給予鋰治療后血清CTX水平顯著降低，而PINP水平顯著增加，和對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

圖4 血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平的改變 A:PINP;B:CTX。注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。Fig.4 Changes in serum bone turnover marker levels A:PINP;B:CTX.

3 討論

本研究使用老年大鼠股骨干模型模擬骨質(zhì)疏松骨折，使用氯化鋰干預(yù)4周后，通過(guò)生化、影像學(xué)以及組織學(xué)來(lái)觀察骨折愈合情況。結(jié)果顯示，氯化鋰干預(yù)后能顯著降低大鼠體內(nèi)骨吸收指標(biāo)水平，并且促進(jìn)骨形成，同時(shí)顯著加速骨折愈合。這些結(jié)果表明，氯化鋰使用可以一定程度地改善骨質(zhì)疏松骨折愈合，不失為一種輔助治療方案。

骨質(zhì)疏松癥的病理狀態(tài)伴隨微結(jié)構(gòu)損傷，過(guò)度炎癥信號(hào)傳導(dǎo)和機(jī)械不穩(wěn)定嚴(yán)重?fù)p害了骨質(zhì)疏松性骨折的早期愈合。因此，早期藥物干預(yù)對(duì)于預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折中不愈合的發(fā)生是有益的和必要的。Wnt /β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Wnt /β-catenin)在骨的形成和再生中也具有重要作用。Wnt /β-catenin的激活通過(guò)Wnt與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5和6共受體以及7跨膜結(jié)構(gòu)域跨越的受體的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)[8]。穩(wěn)定的β-catenin在胞質(zhì)溶膠中聚集并易位至細(xì)胞核。轉(zhuǎn)錄共激活因子隨后與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子(TCF / LEF)相互作用。TCF / LEF是轉(zhuǎn)錄因子，可以介導(dǎo)Wnt對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響，從而上調(diào)成骨細(xì)胞增殖[9]。Wnt /β-catenin途徑通過(guò)刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化而在骨組織再生中起重要作用。氯化鋰可以抑制GSK-3β的活性，GSK-3β被認(rèn)為是Wnt /β-catenin的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[8]。通過(guò)小鼠鋰處理激活Wnt /β-catenin途徑中β-catenin與骨量增加和骨折愈合改善相關(guān)[10]。本研究中使用鋰干預(yù)老年大鼠骨折，發(fā)現(xiàn)骨折愈合顯著加速，這表明氯化鋰在骨質(zhì)疏松骨折治療的有益作用。

骨折愈合過(guò)程非常復(fù)雜，主要分為四個(gè)緊密連接的階段，這些階段是作為應(yīng)對(duì)骨折出現(xiàn)后而開(kāi)始的。骨的形成和再吸收之間的平衡在骨折修復(fù)過(guò)程中起重要作用。PINP和CTX血清水平表明老年骨質(zhì)疏松大鼠骨形成相對(duì)不足。本研究采用開(kāi)放式制作骨折模型，由于骨折模型中的軟組織剝離，使骨膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，并且軟骨內(nèi)骨化在股骨骨折愈合中起著更重要的作用。由血腫形成的半剛性纖維軟骨骨痂組織(軟愈傷組織)在骨折愈合的早期階段提供初始穩(wěn)定性。治療組術(shù)后4周時(shí)觀察到最大體積的軟愈傷組織和一定量的編織骨，同時(shí)生物力學(xué)也有一定的改善。骨折愈合的最后階段主要是受破骨細(xì)胞活性影響的編織骨的重塑過(guò)程。根據(jù)骨折修復(fù)發(fā)生的位置，一些初級(jí)礦化軟骨痂組織逐漸改變并重塑為板層骨或海綿狀骨。在對(duì)照組中，組織學(xué)顯示一部分編織骨在4周時(shí)已經(jīng)形成。然而，治療組中的愈傷組織可見(jiàn)大量小片層和更多編織骨組成。通常，在正常骨折大鼠中，纖維軟骨/軟骨的礦化在4周時(shí)幾乎完成[11]。本研究中采用老年骨質(zhì)疏松大鼠模型，骨吸收增強(qiáng)和骨形成能力不足，纖維軟骨/軟骨的重塑過(guò)程延遲[12-14]。Micro-CT分析和生物力學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這點(diǎn)。

當(dāng)然，本研究也有其局限性。首先，本研究只觀察了4周時(shí)的骨折愈合情況，即骨折早期愈合的影響，關(guān)于8周以及12周時(shí)骨折愈合情況尚不清楚；其次，本研究沒(méi)有進(jìn)一步觀察骨折愈合過(guò)程中Wnt /β-catenin信號(hào)通路變化，因此促進(jìn)骨折愈合的具體機(jī)制不明了，是否是通過(guò)Wnt /β-catenin信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，尚不得而知，雖然理論上可能通過(guò)此通路來(lái)完成；最后，本研究使用的模型是老年大鼠，是否適合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松狀態(tài)還需進(jìn)一步研究。

總之，本次研究表明氯化鋰對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合在骨微結(jié)構(gòu)、力學(xué)性質(zhì)和組織學(xué)方面存在短期影響。