鄒毅 冷華偉 桂鵬 張均泉 張玉峰 王奎 王明輝 葉茂

中國貴航集團三O二醫(yī)院骨科，貴州 安順 561000

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加及臨床表現(xiàn)為骨折危險性增加的骨代謝性疾病，報道[1-2]顯示其具有較高的發(fā)病率，涉及人群較廣，以絕經(jīng)后女性多見。對骨質(zhì)疏松癥的防治已成為國內(nèi)外學(xué)者探討和研究的熱點話題。目前西藥治療骨質(zhì)疏松癥取得了一定的效果，但是不良反應(yīng)較多，不宜長期使用[3-4]。因此，對于中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的研究需進一步的深入探討。

人工虎骨粉為新一代的虎骨替代品，含有豐富的骨膠原、骨肽、成骨元素和骨形成所必需的的鈣、磷，以及微量元素鍶、鎂、鋅、銅、錳等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證實其具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛及抗骨質(zhì)疏松作用[5]，但其作用機制仍不是很明確。本研究主要探討人工虎骨粉對去卵巢大鼠骨組織中Sirt1/Runx2信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：8月齡健康雌性SD大鼠，體重260～310 g，SPF級，分籠飼養(yǎng)，自由進食。飼養(yǎng)環(huán)境：相對濕度55%，溫度22 ℃，12 h明暗周期。實驗符合美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南。

1.1.2主要試劑與儀器：人工虎骨粉(國藥準(zhǔn)字Z20030079)購自金花企業(yè)西安金花制藥廠；大鼠骨鈣素 ELISA 檢測試劑盒(ml002883)、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶ELISA檢測試劑盒(SBJ-R0426)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；戊巴比妥鈉購自武漢易泰科技有限公司上海分公司；Sirt1抗體(ab12193)、Runx2抗體(ab76956)、Foxo1抗體(ab52857)、Foxo3a(ab12162)購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；InAlyzer小型動物雙能X射線儀購自深圳柏安諾科技有限公司；JIDi-17R微量高速冷凍離心機購自廣州吉迪儀器有限公司；PUZS-600 A全自動生化分析儀購自北京普朗新技術(shù)有限公司；HY-0580骨科生物力學(xué)試驗機購自上海衡翼精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1建立去卵巢大鼠模型：按照4 mL/kg的劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，在腰椎沿背部正中線向下做一約2 cm的縱形切口，依次切開皮膚、筋膜與肌肉組織，以手線結(jié)扎輸卵管及其周圍血管，然后將雙側(cè)卵巢切除。將腹膜與肌肉一起縫一針，確認無出血后縫合皮膚。

1.2.2實驗分組：選取60只SD大鼠，隨機分為去卵巢組、人工虎骨粉組、假手術(shù)組3組，每組20只。人工虎骨粉組建立去卵巢大鼠模型，切除卵巢2周后灌胃給予0.24 g/(kg·d)的人工虎骨粉；去卵巢組建立去卵巢大鼠模型，切除卵巢2周后灌胃給予等效劑量的生理鹽水；假手術(shù)組僅切除卵巢周圍脂肪組織，不切除雙側(cè)卵巢，切除卵巢周圍脂肪組織2周后灌胃給予等效劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥12周。實驗過程中將大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食。飼養(yǎng)環(huán)境：相對濕度55%，溫度22 ℃，12 h明暗周期。3組大鼠體重比較無統(tǒng)計學(xué)差異，飼養(yǎng)條件一致。

1.2.3檢測指標(biāo)：給藥12周后，用1%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，置入抗凝管后，4 ℃,3 000 r/min,離心20 min，取血清，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。采集血樣后處死大鼠，分離左側(cè)股骨，清除肌肉組織與結(jié)締組織后稱重量，一部分固定于多聚甲醛中用于組織學(xué)分析，另一部分以生理鹽水浸泡的紗布包裹股骨，保存于-80 ℃環(huán)境中用于骨密度、生物力學(xué)分析與Western Blot檢測。

1.2.4骨密度檢測：常溫靜置解凍股骨標(biāo)本，采用雙能X射線儀檢測骨密度。

1.2.5骨代謝檢測：常溫靜置解凍血清標(biāo)本，置于離心機內(nèi)3 000 r/min離心10 min，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測骨鈣素、抗酒石酸酸性磷酸酶濃度，嚴格按照試劑盒說明書操作；利用全自動生化分析儀檢測鈣、堿性磷酸酶、磷濃度。

1.2.6組織學(xué)觀察：股骨標(biāo)本置于多聚甲醛中固定48 h后，以8%EDTA脫鈣液脫鈣2周，石蠟包埋，10 μm厚度連續(xù)切片，利用電吹風(fēng)融化切片上的石蠟，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，中性樹脂封固后顯微鏡下觀察。

1.2.7骨生物力學(xué)：常溫靜置解凍股骨標(biāo)本，在材料試驗機上進行三點彎實驗，檢測股骨的最大載荷、斷裂載荷、最大應(yīng)力、彈性模量等指標(biāo)，樣本跨度為20 mm，為減小測量誤差，設(shè)置所有股骨標(biāo)本的放置角度、方向與距離一致，設(shè)置加載速度為1 mm/min，垂直于股骨干縱軸方向進進行加載，直至股骨斷裂。

1.2.8Western Blot檢測：常溫靜置解凍股骨標(biāo)本，利用Western Blot檢測 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表達。取股骨組織，加入蛋白裂解液4 ℃研磨勻漿，12 000 r/min離心15 min后吸取上清，利用BCA法檢測蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品→加入6 μL5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液充分混合均勻→100 ℃水浴加熱3 min變性蛋白→制備分離膠與濃縮膠→點樣、電泳→轉(zhuǎn)膜→洗膜→封閉→孵育一抗(37 ℃,1.5 h)→洗膜→孵育二抗(37 ℃,1.5 h)→洗膜→化學(xué)發(fā)光底物(避光反應(yīng)5 min)→暗室曝光→顯影→定影→圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用統(tǒng)計學(xué)軟件22.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為表達格式，采用單因素方差分析結(jié)果，以P<0.05判定為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度

去卵巢組大鼠股骨骨密度低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；人工虎骨粉組大鼠股骨骨密度高于去卵巢組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 骨代謝

與假手術(shù)組比較，去卵巢組骨鈣素、抗酒石酸酸性磷酸酶、血鈣、血磷及堿性磷酸酶濃度均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與去卵巢組比較，人工虎骨粉組骨鈣素、抗酒石酸酸性磷酸酶、血鈣、血磷及堿性磷酸酶濃度均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠股骨骨密度注：與去卵巢組比較，*P<0.05。Fig.1 Bone mineral density of femur in rats in each group

表1 各組大鼠骨代謝指標(biāo) (n=20)Table 1 Bone metabolic indices of rats in each group (n=20)

2.3 組織學(xué)觀察

蘇木精-伊紅染色顯示，假手術(shù)組大鼠骨密質(zhì)較厚且均勻，骨細胞排列整齊，骨小粱結(jié)構(gòu)緊密且連續(xù)性好，鈣鹽沉積均勻；去卵巢組大鼠骨密質(zhì)較假手術(shù)組薄，骨細胞變少且排列紊亂，骨小梁稀疏、纖細、大片斷裂，鈣鹽沉積明顯減少，髓腔相對擴大；與去卵巢組比較，人工虎骨粉組大鼠骨密質(zhì)明顯增厚，骨小梁變粗、變密，橫向聯(lián)接增加。見圖2。

2.4 骨生物力學(xué)

與假手術(shù)組比較，去卵巢組最大載荷、斷裂載荷、最大應(yīng)力、彈性模量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與去卵巢組比較，人工虎骨粉組最大載荷、斷裂載荷、最大應(yīng)力、彈性模量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖2 各組大鼠股骨組織學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色，×200)Fig.2 Histological observation of femur in rats of each group (hematoxylin-eosin staining,×200)

表2 各組大鼠股骨生物力學(xué) (n=20)Table 2 Femoral biomechanics of rats in each group(n=20)

2.5 Western Blot檢測

與假手術(shù)組比較，去卵巢組股骨組織 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與去卵巢組比較，人工虎骨粉組股骨組織 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠股骨組織Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表達 (n=20)注：A：各組股骨組織內(nèi)Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表達Western Blot檢測條帶；B：各組股骨組織內(nèi)Sirt1蛋白半定量分析結(jié)果；C：各組股骨組織內(nèi)Runx2蛋白半定量分析結(jié)果；D：各組股骨組織內(nèi)Foxo1蛋白半定量分析結(jié)果；E：各組股骨組織內(nèi)Foxo3a蛋白半定量分析結(jié)果。與去卵巢組比較，*P<0.05。Fig.3 The expressions of Sirt1,Runx2,Foxo1 and Foxo3a in femoral tissues of rats in each group (n=20)

3 討論

人工虎骨粉具有抗骨質(zhì)疏松作用。何保玉等[6]對160例原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者分別進行口服金天格膠囊(觀察組)與鈣爾奇D3片治療(對照組)，發(fā)現(xiàn)治療后兩組患者腰背疼痛、腰膝酸軟、下肢痿弱、步履艱難等癥狀評分均較治療前明顯改善(P<0.01)，并且治療9個月后觀察組腰椎及股骨Ward三角區(qū)骨密度較治療前明顯提高(P<0.01)，而對照組未見明顯改善，認為金天格膠囊用于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者的治療，可以緩解腰背疼痛、腰膝酸軟、下肢痿弱、步履艱難等癥狀，并能顯著增加骨密度，改善生活質(zhì)量，無明顯不良反應(yīng)。但是有學(xué)者認為人工虎骨粉并不能有效增加骨密度，陳志剛等[7]對120例骨量低下與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者進行口服人工虎骨粉膠囊治療，發(fā)現(xiàn)治療52周后其可抑制骨密度下降、有效緩解骨質(zhì)疏松癥的主要臨床癥狀，但未能顯著提高腰椎和和股骨頸的骨密度。對于人工虎骨粉對骨質(zhì)疏松癥患者骨密度的影響還需要更長期、更大樣本的研究去證實。

本研究結(jié)果顯示切除卵巢14周后，大鼠股骨骨密度下降，血清骨鈣素、抗酒石酸酸性磷酸酶、鈣、磷及堿性磷酸酶濃度均明顯升高，股骨組織呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松病理改變，股骨最大載荷、斷裂載荷、最大應(yīng)力、彈性模量顯著下降，說明實驗造模成功。而經(jīng)過人工虎骨粉干預(yù)后，去卵巢大鼠股骨密度升高，血清骨鈣素、抗酒石酸酸性磷酸酶、鈣、磷及堿性磷酸酶濃度均明顯下降，股骨組織骨質(zhì)疏松病理改變明顯改善，股骨最大載荷、斷裂載荷、最大應(yīng)力、彈性模量顯著升高，證實了人工虎骨粉可抑制骨質(zhì)丟失，增強骨的力學(xué)強度，具有抗骨質(zhì)疏松作用。

多種信號通路參與骨代謝紊亂的調(diào)節(jié)[8-9]。Sirt1是哺乳動物中與酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源性最高且具有NAD+依賴的蛋白去乙?；富钚缘亩喙δ苷{(diào)節(jié)因子，與基因轉(zhuǎn)錄、細胞衰老及能量代謝等過程的調(diào)節(jié)相關(guān)。大量的研究[10-11]已證實Sirt1與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。研究[12]發(fā)現(xiàn)白葫蘆醇可通過促進Sirt1與成脂轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合阻礙骨髓間充質(zhì)細胞向脂肪細胞的分化，進而促進骨形成。成脂轉(zhuǎn)錄因子也可抑制Runx2基因的轉(zhuǎn)錄活性及成骨信號通路，包括Wnt與轉(zhuǎn)化生長因子/骨形態(tài)發(fā)生蛋白等。Runx2是啟動成骨轉(zhuǎn)錄程序的早期主要因子，可誘導(dǎo)成骨細胞特異性基因的表達，如骨橋蛋白、骨鈣素與堿性磷酸酶等。Sirt1//Foxo3A的過表達或沉默可影響Runx2啟動子的活性，沉默F(xiàn)oxo1表達也可降低Runx2的表達，抑制骨形成[13-14]。由此可知Sirt1蛋白參與骨形成過程，F(xiàn)oxo1、Foxo3A、成脂轉(zhuǎn)錄因子等發(fā)揮了重要角色，而最終的調(diào)節(jié)目標(biāo)是Runx2，所以筆者認為Sirt1/Runx2信號通路可能是未來研究防治骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要研究方向。本研究結(jié)果顯示切除卵巢14周后，大鼠股骨組織 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表達降低，證實Sirt1/Runx2信號通路參與了骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展；而人工虎骨粉干預(yù)后，去卵巢大鼠股骨組織 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表達升高，說明Sirt1/Runx2信號通路在人工虎骨粉治療骨質(zhì)疏松過程中發(fā)揮了積極作用。

綜上，人工虎骨粉可能通過調(diào)節(jié)Sirt1/Runx2信號通路發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用，但是骨質(zhì)疏癥的病理機制較復(fù)雜，涉及的信號通路較多，因此有關(guān)人工虎骨粉防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制還有待進一步研究、闡明。