張靜，張孟丹，梁俊平，許振山，王先鋒，郭文麗，張建新，李慧

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007）

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，2018 年淡水魚類養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)2544.28 萬t，其中鯉Cyprinus carpio 產(chǎn)量達(dá)296.22 萬t[1]。鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，對(duì)飼料的需求量越來越大，而魚粉等蛋白飼料資源日益缺乏且價(jià)格昂貴，因此，尋求適宜的植物替代蛋白已成為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一[2]。

棉粕來源廣、產(chǎn)量高、價(jià)格低廉、蛋白含量豐富，已成為水產(chǎn)飼料中的重要蛋白來源之一。然而，棉粕賴氨酸水平較低，且含有游離棉酚，特別是棉酚過量蓄積會(huì)引起水產(chǎn)動(dòng)物生長受阻，肝、腎等組織病變[3-5]，限制了棉粕的廣泛應(yīng)用[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)日糧中添加300～900 mg/kg 醋酸棉酚，投喂8周后，異育銀鯽Carassius auratus gibelio 的增重率、特定生長率隨著醋酸棉酚添加量的增加而下降；添加900 mg/kg 醋酸棉酚組異育銀鯽肥滿度、肝臟指數(shù)、血清堿性磷酸酶活力顯著下降，血清轉(zhuǎn)氨酶活力顯著升高，而添加300 mg/kg 醋酸棉酚組，其肝臟指數(shù)和血清生化指標(biāo)與對(duì)照組無顯著差異[3]。在飼料中添加1200 mg/kg 醋酸棉酚，經(jīng)過8 周的投喂，會(huì)引起奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus× O.aureus）增重率、飼料利用率下降，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力升高；當(dāng)添加量低于600mg/kg 時(shí)，對(duì)羅非魚的生長性能及血清生化指標(biāo)無明顯影響[4]。鯉攝食含游離棉酚647mg/kg 的飼料8 周后，增重率、飼料轉(zhuǎn)化率顯著下降，血清轉(zhuǎn)氨酶活力、羥基自由基含量升高；當(dāng)飼料中游離棉酚含量低于215.7mg/kg 時(shí)，對(duì)上述指標(biāo)無顯著影響[5]。由此可見，在一定劑量范圍內(nèi)，水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)游離棉酚具有一定的耐受性。但是，水產(chǎn)動(dòng)物解游離棉酚毒、降低其損傷的機(jī)理，目前仍無深入研究。

《GB 13078-2017 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定：雜食性水產(chǎn)動(dòng)物飼料中游離棉酚含量低于300 mg/kg，按照每日攝食量3%左右計(jì)算，日攝食游離棉酚約為10mg/kg 體質(zhì)量。本研究通過給鯉單次口灌10 mg/kg體質(zhì)量劑量的醋酸棉酚，分析鯉體內(nèi)醋酸棉酚含量變化與血清轉(zhuǎn)氨酶、藥物代謝酶CYP3A、抗氧化酶sod、cat、gpx 基因表達(dá)間的關(guān)系，以期為揭示魚類解毒游離棉酚的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用鯉購于鄭州市中牟縣某養(yǎng)殖場，平均體質(zhì)量（55±2.5）g，在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)2 周。暫養(yǎng)期間，自然光照，水溫控制在23℃左右，每周清洗濾網(wǎng)3 次，換水一次，換水量為養(yǎng)殖水體的1/3，每天按魚體質(zhì)量的3%，在9:00、12:00 和18:00 投喂基礎(chǔ)飼料，正式實(shí)驗(yàn)前停食24 h。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。熒光定量試劑盒購于TaKaRa 生物技術(shù)有限公司。醋酸棉酚（純度＞97.5%）購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。氯化鈉（分析純）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

醋酸棉酚懸濁液配制：準(zhǔn)確稱取0.056 g 醋酸棉酚，用0.65%的無菌生理鹽水定容至10 mL，超聲助溶，配制成濃度為5.5 mg/mL 的醋酸棉酚懸濁液。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、給藥及取樣

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和棉酚組2 組。棉酚組，每尾魚用1mL 無菌注射器（棄掉針頭） 吸取0.1mL 5.5mg/mL 醋酸棉酚懸濁液（劑量相當(dāng)于10mg/kg 魚體質(zhì)量）灌入鯉前腸，對(duì)照組以同樣方式給每尾魚灌入0.1mL 0.65%的無菌生理鹽水，分別于給藥后1h、4h、12h、24h、48h 和72h 尾靜脈采血，采得的血液室溫靜置3h，5000r/min 離心15min，收集血清后-80℃冷凍保存；同時(shí)解剖取肝胰臟、前腸、中腸、膽囊。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取7 尾魚，各組織于液氮速凍后-80℃冷凍保存，用于醋酸棉酚含量及基因表達(dá)分析。

1.2.2 醋酸棉酚含量的測定

（1）樣品預(yù)處理

血清、膽汁處理：血清、膽汁樣品于室溫下自然解凍，混勻后，每個(gè)血清樣品吸取500 μL，每個(gè)膽汁樣品吸取100μL 至10mL 離心管，加入3mL 丙酮，渦旋30s，室溫避光靜置2h，4500r/min 離心15min，移上清至10mL 玻璃離心管，吹氮?dú)馐贡獡]發(fā)，加入70%丙酮-磷酸溶液使殘留物充分溶解，0.22μm有機(jī)濾膜過濾后-20℃保存，用于檢測醋酸棉酚的含量。

組織處理：將組織樣本液氮研磨混勻后，準(zhǔn)確稱取一定的量（肝胰臟0.5g、前腸0.25g、中腸0.4g）于10mL 離心管中，先加入1mL 丙酮，12000r/min 勻漿10s，再加2mL 丙酮清洗刀頭2 次，合并3 次液體于離心管中，渦旋30s，室溫避光靜置2h，4500r/min離心15min，移上清至10 mL 玻璃離心管，吹氮?dú)?、殘留物溶解和有機(jī)濾膜過濾及保存同上。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取0.0102 g 醋酸棉酚，溶于70%丙酮-磷酸溶液，定容至100mL，超聲波超聲30 min 使其完全溶解，即為100μg/mL 的棉酚標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，再用70%丙酮-磷酸溶液將其依次稀釋為100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL 和1μg/mL 的棉酚標(biāo)準(zhǔn)品工作液，分別加入盛有一定量空白組織的10mL 離心管中，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)重復(fù)，使醋酸棉酚標(biāo)準(zhǔn)品與空白組織充分混合，室溫靜置2h 后按照組織樣品的處理方法進(jìn)行前處理。HPLC 檢測各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

（3）檢測條件

高效液相色譜儀：Agilent 1260；

色譜柱：Agilent Tc-C18，250 mm×5 μm，5μm

檢測波長：235 nm；

柱溫：40℃；

流動(dòng)相：血清為88%甲醇-12%磷酸溶液，肝胰臟、腸道、膽汁為85%甲醇-15%磷酸溶液；

流速：1 mL/min；

進(jìn)樣量：血清、肝胰臟、膽汁為10μL，前腸、中腸為20μL。

1.2.3 血清轉(zhuǎn)氨酶活力的測定

血清樣品室溫自然解凍、混勻后，按照說明書將各試劑及樣品加入96 孔板，用酶標(biāo)儀檢測各孔OD，代入公式計(jì)算各樣品酶活力，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示。

1.2.4 基因表達(dá)量檢測

根據(jù)Trizol 法提取肝胰臟、腸道總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 檢測RNA 樣品的質(zhì)量和濃度。利用TaKaRa 公司的PrimeScriptRT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈。采用Primer 5設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

將合成的cDNA 稀釋后作為模板，采用TB GreenⅡ染料法，用Light Cycler 96 熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。按TaKaRa SYBRPrimeScript TM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒說明書進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃20 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸棉酚在鯉血清、肝胰臟、腸道內(nèi)的濃度變化

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的特異性引物Tab.1 The primers used in this study

如圖1 所示，以10mg/kg 魚體質(zhì)量劑量給鯉單次口灌醋酸棉酚后，鯉血清中醋酸棉酚的濃度隨口灌時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，在4h 上升到最大值5.47μg/mL（P＜0.05），24h 下降至1.74μg/mL，72h 達(dá)到最低為0.50μg/mL（P＜0.05）。

如圖2 所示，醋酸棉酚在前腸中的濃度隨口灌時(shí)間的延長而下降，1h 達(dá)到最大值23.16μg/g（P＜0.05），72h 降至0μg/g；醋酸棉酚在中腸中的濃度隨口灌時(shí)間的延長，呈波浪式先上升后下降的趨勢，其濃度在口灌后24h 達(dá)到最大值22.11μg/g（P＜0.05），72h 降至0.34μg/g；醋酸棉酚在肝胰臟中的濃度隨口灌時(shí)間的延長呈波浪式下降趨勢，在口灌后1h 即達(dá)到最高濃度21.31μg/g（P＜0.05），72h 降至2.02μg/g；醋酸棉酚在膽汁中的濃度隨口灌時(shí)間的延長呈波浪式下降，口灌后1h 達(dá)到峰值為12.54 μg/mL（P＜0.05），72h 降至3.19μg/mL。

2.2 醋酸棉酚對(duì)鯉血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的影響

如圖3、圖4 所示，單次口灌10mg/kg 醋酸棉酚后的1h、4h、12h、24h、48h 和72h，鯉血清GPT 活力均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），血清GOT 除12h 以外，其余時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組，其中在1h、4h、48h 顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 醋酸棉酚對(duì)鯉肝胰臟、腸道CYP3A 相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖5～7 所示，給鯉單次口灌10mg/kg 劑量醋酸棉酚后，肝胰臟CYP3A 的相對(duì)表達(dá)量在1～72 h顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），12h 上升至最大值，為對(duì)照組的4.71 倍，隨口灌時(shí)間的延長，CYP3A 的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，在72h 下降到最小值，為對(duì)照組的1.29 倍。前腸CYP3A 的表達(dá)量在口灌后的1h、4h、12h、24h 和72h 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隨口灌時(shí)間的延長，基本呈上升趨勢，在口灌后72h 上升至最大值，為對(duì)照組的7.61 倍。中腸CYP3A 的表達(dá)量在口灌后的1～72h 均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨口灌時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，在12h上升至最大值，為對(duì)照組的5.03 倍，之后逐漸下降。

2.4 醋酸棉酚對(duì)鯉肝胰臟sod、cat、gpx 基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4.1 醋酸棉酚對(duì)鯉肝胰臟sod 基因相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖8 所示，給鯉單次口灌10mg/kg 劑量的醋酸棉酚后，肝胰臟sod 基因表達(dá)量隨口灌時(shí)間的延長，呈先上升后下降的趨勢，在24h 升到最大值，為對(duì)照組的1.47 倍；與對(duì)照組相比，鯉胰肝sod 基因表達(dá)量在口灌后的1 h、4 h、12 h、24 h、48 h、72 h 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4.2 醋酸棉酚對(duì)鯉肝胰臟gpx 相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖9 可知，鯉肝胰臟gpx 基因表達(dá)量隨口灌時(shí)間的延長呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，在口灌后1h 顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），在口灌后4h 與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05），在口灌后的12～72h 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別為對(duì)照組的1.24、1.24、1.18、1.11 倍。

2.4.3 醋酸棉酚對(duì)鯉肝胰臟cat 基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖10 可知，鯉肝胰臟cat 基因表達(dá)量隨口灌時(shí)間的延長呈先上升再下降的趨勢，24h 時(shí)升至最大值，為對(duì)照組的2.01 倍；1h 時(shí)與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），4～72h 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 醋酸棉酚在鯉血清、肝胰臟、腸道和膽汁內(nèi)的含量變化

薛社普等[10]用C14標(biāo)記法研究發(fā)現(xiàn)：醋酸棉酚在大鼠體內(nèi)經(jīng)腸道吸收后，主要通過膽汁、糞便排出體外。劉紅明[11]研究表明：棉酚在大鼠腸道中吸收后，在肝臟中主要通過葡萄糖醛酸化途徑代謝，后經(jīng)膽汁、糞便排泄。本研究發(fā)現(xiàn)，給鯉單次口灌醋酸棉酚后，血清中醋酸棉酚在4h 達(dá)到峰值，而前腸、肝胰臟內(nèi)醋酸棉酚濃度在1h 就達(dá)到峰值，說明醋酸棉酚首先在前腸吸收后，通過門靜脈進(jìn)入肝臟，之后進(jìn)入血液循環(huán)[11]。而棉酚溶液在腸內(nèi)隨著腸道蠕動(dòng)向后遷移[12]，中腸內(nèi)醋酸棉酚在24h 才達(dá)到峰值。膽汁中醋酸棉酚濃度隨著時(shí)間變化有所降低，但在4h 后一直高于血液中濃度，推測經(jīng)膽汁排泄可能是鯉排泄棉酚的重要途徑之一。而經(jīng)膽汁排泄到腸道內(nèi)的棉酚再次經(jīng)過腸道吸收而進(jìn)入肝臟，所以在24h 時(shí)肝臟中醋酸棉酚又有所升高?？梢姡姿崦薹釉邗幬?、排泄中存在“肝腸循環(huán)”現(xiàn)象。

3.2 醋酸棉酚對(duì)鯉血清轉(zhuǎn)氨酶活力的影響

動(dòng)物長期攝食含有游離棉酚的飼料后，游離棉酚主要蓄積在肝臟，當(dāng)蓄積量超過機(jī)體的耐受范圍時(shí)，便會(huì)影響肝功能[3，5]。GPT 和GOT 是一類廣泛分布于動(dòng)物肝細(xì)胞線粒體中的氨基轉(zhuǎn)移酶，正常情況下，在血清中活力較低，當(dāng)肝臟發(fā)生病變、功能受損時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的GPT 和GOT 會(huì)釋放滲入血液，導(dǎo)致血清中這兩種酶活力上升，因此，其活性升高是反映肝功能受損的重要指標(biāo)[5，13]。在基礎(chǔ)飼料中添加300mg/kg 醋酸棉酚投喂異育銀鯽8 周后，血清GPT和GOT 活力無明顯變化，當(dāng)基礎(chǔ)飼料中添加900mg/kg 醋酸棉酚時(shí)，會(huì)引起異育銀鯽血清GPT、GOT 活力顯著升高[3]；在鯉飼料中添加323mg/kg 游離棉酚投喂8 周后，對(duì)血清GOT、GPT 活力無顯著影響，當(dāng)游離棉酚添加量超過431mg/kg 后，會(huì)引起鯉血清轉(zhuǎn)氨酶活力顯著升高（P＜0.05）[5]。在基礎(chǔ)飼料中添加不同比例的刺五加、枸杞子、金銀花和黃芪配伍的復(fù)方中草藥飼喂42d 后，鏡鯉血清GOT、GPT 活力顯著下降，認(rèn)為復(fù)方中草藥在一定程度上起了保護(hù)肝臟的作用[14]。本研究結(jié)果顯示，鯉單次口灌10mg/kg 醋酸棉酚后，血清GPT 和GOT 并未升高，卻在一定程度降低了。這可能是在低劑量條件下，醋酸棉酚激活了體內(nèi)解毒酶活性，將醋酸棉酚代謝成為毒性更小的物質(zhì)，減弱了對(duì)肝臟的損傷作用。有研究發(fā)現(xiàn)，醋酸棉酚可保護(hù)大鼠糖尿病引起的腎臟、肝臟損傷[15，16]。低劑量醋酸棉酚對(duì)鯉肝臟是否也有一定保護(hù)作用，需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 醋酸棉酚對(duì)鯉肝胰臟、腸道CYP3A 表達(dá)量的影響

CYP3A 是一種重要的藥物代謝酶，在P450 酶家族中占30%～40%，主要分布在肝臟和腸道內(nèi)，參與人體內(nèi)約60%的藥物代謝，在藥物、毒物代謝過程中發(fā)揮重要作用[17-20]。給異育銀鯽注射25～100 mg/kg 魚體質(zhì)量劑量的黃連素，抑制了CYP3A 基因的mRNA 表達(dá)及標(biāo)志酶ERND 的活性，并呈劑量依賴效應(yīng)，當(dāng)黃連素與CYP3A 代謝的其他藥物聯(lián)合用藥時(shí)，能提高其他藥物的療效，減少其用量[21]。將鯽暴露于0.165mg/L 和0.330 mg/L 有機(jī)磷農(nóng)藥辛硫磷溶液中96 h 后，鯽肝臟CYP3A mRNA 表達(dá)及酶活力均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）[22]；將白鰱Hypophthalmicthys molitlis 暴露于0.017mg/L 和0.103mg/L殺蟲劑毒死蜱溶液中24h 后，與對(duì)照組相比，白鰱CYP3A mRNA 表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）[23]；給大菱鲆Scophthalmus maximus 連續(xù)口灌50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg 魚體質(zhì)量劑量的磺胺二甲嘧啶5d 后，各處理組CYP3A 基因的相對(duì)表達(dá)量在口灌后的1～9d 均發(fā)生不同程度的上調(diào)，其中200 mg/kg 磺胺二甲嘧啶組CYP3A 基因的相對(duì)表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）[24]；將鯉暴露于0mg/kg、50mg/kg、100mg/kg 的利福平溶液中，8～24h 時(shí)，隨著利福平濃度及暴露時(shí)間的增加，各處理組鯉肝胰臟CYP3A 基因的相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）[18]。由此可見，不同毒物或藥物進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后對(duì)CYP3A 基因表達(dá)的影響不同。本研究發(fā)現(xiàn)，按照體質(zhì)量給鯉單次口灌10mg/kg 劑量的醋酸棉酚，在口灌后的1～72h，肝胰臟、中腸CYP3A基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。推測鯉CYP3A 在醋酸棉酚代謝中起到了重要作用，促進(jìn)了其在體內(nèi)消除速率，使血清、肝、腸道內(nèi)的醋酸棉酚含量降低。

3.4 醋酸棉酚對(duì)鯉肝胰臟抗氧化酶sod、cat、gpx 表達(dá)量的影響

細(xì)胞色素P450 酶家族在催化毒物、藥物代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基[25]，棉酚自身也會(huì)引起動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生大量自由基[26]。自由基在機(jī)體內(nèi)過量累積，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞生物膜結(jié)構(gòu)，損害蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子[27]。為防止氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷，生物體內(nèi)形成了一套抗氧化防御系統(tǒng)以清除自由基，主要包括抗氧化酶SOD、CAT、GSH-px 等[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，給鯉單次口灌10mg/kg劑量的醋酸棉酚，鯉肝胰臟sod 表達(dá)量在1～72h 內(nèi)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），gpx、cat 表達(dá)量除1h 以外，其他時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組。結(jié)果說明，低劑量醋酸棉酚誘導(dǎo)了肝臟抗氧化酶基因表達(dá)，抗氧化酶對(duì)自由基的消除速率加快，減輕了機(jī)體的損傷。