王常瞵 叢竹鳳 劉國(guó)飛 王少平 向澤棟 董萍萍 孫平 趙紅金 高鵬 代龍

摘 要 目的：研究水蛭不同炮制品對(duì)急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)及凝血指標(biāo)的影響。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，阿司匹林組，水蛭吊干品低、中、高劑量組，水蛭滑石粉燙制品低、中、高劑量組，水蛭酒潤(rùn)麩制品低、中、高劑量組，每組6只。除空白組外，其余各組大鼠以皮下注射鹽酸腎上腺素加冰水浴復(fù)制急性血瘀模型，造模時(shí)間15 d。從造模的第8天起，阿司匹林組大鼠灌胃阿司匹林0.2 g/kg，水蛭炮制品各劑量組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（0.35、1.4、3.5 g/kg，均以生藥量計(jì)），空白組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)8 d。測(cè)定各組大鼠的全血黏度（低、中、高切變率）、血漿黏度、紅細(xì)胞變形指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞壓積等血液流變學(xué)指標(biāo)以及凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血酶原時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）等凝血指標(biāo)。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠不同切變率下的全血黏度和血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞壓積均顯著升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低，PT、TT、APTT均顯著縮短（P<0.01）。與模型組比較，阿司匹林組和水蛭吊干品、滑石粉燙制品、酒潤(rùn)麩制品高劑量組大鼠不同切變率下的全血黏度和血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞壓積均顯著降低，紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著升高，PT（僅水蛭滑石粉燙制品高劑量組）、APTT（除水蛭吊干品高劑量組外）、TT均顯著延長(zhǎng);水蛭吊干品中劑量組大鼠低切變率下的全血黏度以及水蛭滑石粉燙制品低劑量組和酒潤(rùn)麩制品中劑量組大鼠低、中切變率下的全血黏度均顯著降低;水蛭滑石粉燙制品中劑量組大鼠紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著升高，紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著降低，PT和TT顯著延長(zhǎng);水蛭吊干品中劑量組大鼠的APTT顯著延長(zhǎng);水蛭酒潤(rùn)麩制品低劑量組大鼠紅細(xì)胞壓積顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：水蛭吊干品、滑石粉燙制品、酒潤(rùn)麩制品均能夠有效改善急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)、延長(zhǎng)凝血時(shí)間。

關(guān)鍵詞 水蛭;炮制品;急性血瘀;血液流變學(xué)指標(biāo);凝血指標(biāo);大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of different processed products of Whitmania pigra on hemorheology and coagulation indexes in acute blood stasis model rats. METHODS： SD rats were randomly divided into blank group， model group， aspirin group，W. pigra hang-dried product low-， medium- and high-dose groups，W. pigra talcum powder-ironed product low-， medium- and high-dose groups， W. pigra wine bran-processed product low-， medium- and high-dose groups， with 6 rats in each group. Except for blank group，other groups received subcutaneous injection of epinephrine hydrochloride and ice water bath for 15 d to induce acute blood stasis model. From the 8th day of modeling， rats in aspirin group were given aspirin 0.2 g/kg intragastrically. Rats in each dose group of W. pigra processed products were given relevant medicine 0.35， 1.4， 3.5 g/kg intragastrically （calculated by crude drug）. Rats in blank group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day， for consecutive 8 days.? Hemorheology indexes as whole blood viscosity （high， medium and low shearrate），plasma viscosity，erythrocyte deformation index，erythrocyte aggregation index，hematocrit， and? blood coagulation indexes as prothrombin time （PT）， activated partial prothrombin time （APTT）， thrombin time （TT）were determined. RESULTS： Compared with blank group，whole blood viscosity under different shear rates， plasma viscosity， erythrocyte aggregation index and hematocrit of model group were increased significantly， while erythrocyte deformation index was significantly decreased， PT， TT and APTT were significantly shortened（P<0.01）. Compared with model group，whole blood viscosity under different shear rates， plasma viscosity， erythrocyte aggregation index and hematocrit of aspirin group and W. pigra hang-dried product， talcum powder-ironed product，wine bran-processed product high-dose groups were decreased significantly， while erythrocyte deformation index were significantly increased， and PT （only W. pigra talcum powder-ironed products high-dose group）， APTT （except for W. pigra hang-dried products high-dose group） and TT were prolonged significantly. The whole blood viscosity of? W. pigra hang-dried product medium-dose group under low shear rate， and those of W. pigra talcum powder-ironed product low-dose，wine bran-processed product medium-dose groups under low and medium shear rates were decreased significantly. Erythrocyte deformation index of W. pigra talcum powder-ironed product medium-dose group was increased significantly， while erythrocyte aggregation index was decreased significantly，and PT， TT were prolonged significantly. APTT of W. pigra hang-dried product medium-dose group was prolonged significantly. Hematocrit of W. pigra wine bran-processed product low-dose group was decreased significantly（P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： W. pigra hang-dried， talcum powder-ironed and wine bran-processed product can effectively improve hemorheology indexes and prolong blood coagulation time.

KEYWORDS? ?Whitmania pigra; Processing products; Acute blood stasis; Hemorheology indexes; Blood coagulation indexes; Rats

水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蟥（Whitmania pigra Whitman）、水蛭（Hirudo nipponica Whitman）或柳葉螞蟥（W. acranulata Whitman）的干燥全體。夏、秋二季捕捉，用沸水燙死，曬干或低溫干燥即得[1]。水蛭為臨床常用的一味活血化瘀類中藥，具有抗凝、抑制血栓形成、改善血液流變學(xué)等作用[2]，在心腦血管疾病治療方面具有顯著的療效[3]。寬體金線蛭（W. pigra whitman，后文所指水蛭均為該品種）]為水蛭道地藥材，產(chǎn)于山東省微山湖地區(qū)，其炮制品是當(dāng)前藥材市場(chǎng)流通和臨床應(yīng)用的主流品種[4-6]，常見的炮制品包括吊干品、滑石粉燙制品和酒潤(rùn)麩制品。

中醫(yī)“血瘀證”為一系列心血管疾病的統(tǒng)稱，以疼痛、腫塊、出血、舌紫、脈澀等為主要證候。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，血瘀證的形成主要可以概括為兩點(diǎn)：其一為外因，主要是六淫（風(fēng)寒暑濕燥熱），以風(fēng)、寒最甚;其二為內(nèi)因，主要為情志內(nèi)傷、久病血虧、氣血不順?，F(xiàn)代研究表明，血液流變學(xué)、血液循環(huán)及血液理化性質(zhì)的改變是血瘀證發(fā)生的主要生理病理基礎(chǔ)[7]。血瘀證的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)指標(biāo)涉及血液流變學(xué)、凝血、血液動(dòng)力學(xué)、血小板聚集、微循環(huán)、血管阻塞、超微結(jié)構(gòu)改變等7個(gè)方面，其中血液流變學(xué)和凝血指標(biāo)是血瘀證診斷和活血化瘀類中藥研究的主要指標(biāo)[8]。

現(xiàn)有研究表明，水蛭藥材或其提取物對(duì)急性血瘀證具有很好的改善作用，能夠明顯降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液黏度和血漿黏度[9-10]，顯著延長(zhǎng)凝血時(shí)間和小鼠斷尾出血時(shí)間，降低血小板聚集率[11]等。然而研究水蛭不同炮制品對(duì)急性血瘀證血液流變學(xué)及體內(nèi)凝血指標(biāo)的影響尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立急性血瘀大鼠模型，研究水蛭不同炮制品對(duì)其血液流變學(xué)及體內(nèi)凝血指標(biāo)的影響，為水蛭藥材及其炮制品臨床治療血瘀證提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Xi1000型全自動(dòng)凝血測(cè)試儀（北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司）;N6C型全自動(dòng)血液流變儀（北京普利生儀器有限公司生產(chǎn)）;XS105 型 十萬分之一電子天平（瑞士 Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

水蛭藥材（批號(hào)：20190322），由江蘇鵬至生態(tài)養(yǎng)殖有限公司提供，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)專業(yè)徐凌川副教授鑒定為水蛭科動(dòng)物寬體金線蛭（W. pigra Whitman）的干燥全體。鹽酸腎上腺素對(duì)照品（批號(hào)：20190522，純度：≥99%）、檸檬酸鈉對(duì)照品（批號(hào)：20190403，純度：≥99.5%）均由上海源葉生物科技有限公司提供;水合氯醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20190725）;凝血酶原時(shí)間（PT）（批號(hào)：20191212）、活化部分凝血酶原時(shí)間（APTT）（批號(hào)：20191212）、凝血酶時(shí)間（TT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20191212）均由北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司提供;阿司匹林腸溶片（批號(hào)：190411202，規(guī)格：25 mg/片、生理鹽水（批號(hào)：1910242706）均由辰欣藥業(yè)股份有限公司提供;黃酒（浙江塔牌紹興酒有限公司，批號(hào)：20180807，酒精度：15%～16%）;滑石粉（安徽百禾堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：180100306）;麥麩皮（市售）;其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠72只，雌性，體質(zhì)量（200±10）g，由山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003。

2 方法

2.1 水蛭的炮制

2.1.1 吊干品 參考文獻(xiàn)方法[1]，取100 g水蛭藥材去除雜質(zhì)（凈制），切段，粉碎，過五號(hào)篩，得到水蛭吊干品。

2.1.2 滑石粉燙制品 參考文獻(xiàn)方法[12]，將50 g滑石粉置于鍋內(nèi)，武火加熱至靈活狀態(tài)后，加入水蛭吊干品100 g，不斷翻動(dòng)，燙至微鼓起時(shí)取出，篩去滑石粉，放涼，粉碎，過五號(hào)篩，得到水蛭滑石粉燙制品。

2.1.3 酒潤(rùn)麩制品 參考文獻(xiàn)方法[13]，取100 g水蛭吊干品，切段，用10 g黃酒拌勻，悶潤(rùn)至透心;用中火將鍋燒熱，再將10 g麥麩皮均勻撒入鍋內(nèi)，待冒煙時(shí)，倒入酒潤(rùn)水蛭段，拌炒至水蛭表面呈黃色，有特殊氣味逸出時(shí)，迅速取出，篩出焦麥麩，放涼，粉碎，過五號(hào)篩，得到水蛭酒潤(rùn)麩制品。

2.2 分組、造模與給藥

根據(jù)文獻(xiàn)方法[14]，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將其隨機(jī)分為12組，分別為空白組，模型組，阿司匹林組（陽性對(duì)照），水蛭吊干品低、中、高劑量組，水蛭滑石粉燙制品低、中、高劑量組，水蛭酒潤(rùn)麩制品低、中、高劑量組，每組6只。除空白組大鼠皮下注射等體積生理鹽水外，其余各組大鼠每日2次皮下注射鹽酸腎上腺素0.9 mg/kg（溶劑為生理鹽水，每次間隔4 h），并在第1次皮下注射2 h后，將大鼠置于冰水浴中4 min。重復(fù)上述操作15 d以復(fù)制急性血瘀模型[14-16]。從造模的第8天起，根據(jù)文獻(xiàn)方法[8，9]設(shè)置給藥劑量，水蛭炮制品各劑量組大鼠每日在第2次注射鹽酸腎上腺素1 h后分別按0.35、1.4、3.5 g/kg（以生藥量計(jì)，溶劑為生理鹽水）灌胃相應(yīng)炮制品，阿司匹林組大鼠同時(shí)間段內(nèi)按0.2 g/kg（溶劑為生理鹽水）灌胃阿司匹林，空白組和模型組大鼠同時(shí)間段內(nèi)灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)8 d。

2.3 血樣采集

末次給藥第2天，所有大鼠均禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛麻醉后，于腹主動(dòng)脈取血約8 mL，其中4 mL全血分裝于肝素抗凝管中，其余4 mL全血加入3.2%枸櫞酸鈉（血液與抗凝劑體積比為9 ∶ 1）抗凝。

2.4 血液流變學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)

打開血液流變儀，預(yù)溫15 min至37 ℃。取“2.3”項(xiàng)下肝素抗凝管中的全血，混勻后取適量測(cè)定在低、中、高切變率（10、60、150 s-1）下的全血黏度，以及紅細(xì)胞變形指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞壓積;剩余全血經(jīng)3 500 r/min離心15 min，制備貧血小板血漿（PPP），測(cè)定血漿黏度。

2.5 凝血指標(biāo)的檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下經(jīng)3.2%枸櫞酸鈉抗凝的全血，以3 500 r/min離心15 min，制備PPP。

2.5.1 PT的測(cè)定 取50 ?L的PPP，37 ℃溫育3 min，加入PT試劑100 ?L，混勻，靜置，記錄血漿凝固時(shí)間（即PT）。

2.5.2 APTT的測(cè)定 取PPP、APTT試劑各50 ?L，混勻，37 ℃溫育3 min，加入氯化鈣溶液50 ?L，記錄血漿凝固時(shí)間（即APTT）。

2.5.3 TT的測(cè)定 取100 ?L的PPP，37 ℃溫育3 min，加入TT試劑100 ?L，混勻，靜置，記錄血漿凝固時(shí)間（即TT）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 全血黏度和血漿黏度

與空白組比較，模型組大鼠低、中、高切變率下的全血黏度和血漿黏度均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，阿司匹林組和水蛭吊干品、滑石粉燙制品、酒潤(rùn)麩制品高劑量組大鼠低、中、高切變率下的全血黏度和血漿黏度以及水蛭滑石粉燙制品低劑量組和水蛭酒潤(rùn)麩制品中劑量組大鼠低、中切變率下的全血黏度均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠全血黏度和血漿黏度的檢測(cè)結(jié)果見表1。

3.2 紅細(xì)胞變形指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞壓積

與空白組比較，模型組大鼠紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低，紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞壓積均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，阿司匹林組和水蛭吊干品、滑石粉燙制品、酒潤(rùn)麩制品高劑量組大鼠的紅細(xì)胞變形指數(shù)均顯著升高，紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞壓積均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;水蛭滑石粉燙制品中劑量組大鼠的紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著升高，紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著降低（P<0.05或P<0.01）;水蛭酒潤(rùn)麩制品低劑量組大鼠的紅細(xì)胞壓積顯著降低（P<0.05）。各組大鼠紅細(xì)胞變形指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞壓積的檢測(cè)結(jié)果見表2。

3.3 凝血指標(biāo)

與空白組比較，模型組大鼠的PT、TT、APTT均顯著縮短（P<0.01）。與模型組比較，水蛭滑石粉燙制品中、高劑量組大鼠的PT;阿司匹林組，水蛭吊干品中劑量組和滑石粉燙制品、酒潤(rùn)麩制品高劑量組大鼠的APTT以及阿司匹林組，水蛭滑石粉燙制品中、高劑量組和吊干品、酒潤(rùn)麩制品高劑量組大鼠的TT均顯著延長(zhǎng)（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠凝血指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果見表3。

4 討論

參考文獻(xiàn)方法[14-16]，本研究通過注射鹽酸腎上腺素致使大鼠體溫升高、心率加快來模擬暴怒時(shí)的機(jī)體變化，同時(shí)結(jié)合冰水浴浸泡來模擬寒邪;二者共同作用引起血瘀證，以此復(fù)制急性血瘀模型。此外，本研究利用雌性大鼠易怒、機(jī)體變化受溫度影響較大的特點(diǎn)，選用雌性大鼠進(jìn)行造模。此模型與臨床相關(guān)性較強(qiáng)，且成功率較高、應(yīng)用廣泛[17]。

阿司匹林為臨床廣泛使用的治療心血管疾病的藥物，給藥方式為口服，與水蛭各炮制品相同，具有可比性，故將其作為陽性藥物。通過灌胃阿司匹林及水蛭各炮制品，檢測(cè)大鼠體內(nèi)血液流變學(xué)和凝血等指標(biāo)，并與模型組比較，探討水蛭各炮制品對(duì)急性血瘀證的改善作用。本研究結(jié)果顯示，各劑量水蛭吊干品、滑石粉燙制品、酒潤(rùn)麩制品均能不同程度地降低急性血瘀模型大鼠的全血黏度和血漿黏度，證實(shí)了水蛭在臨床實(shí)踐中降低血液黏度、改善血液性質(zhì)的作用。紅細(xì)胞變形聚集和紅細(xì)胞壓積等微觀血液流變學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，適宜劑量水蛭吊干品、滑石粉燙制品、酒潤(rùn)麩制品能夠升高模型大鼠紅細(xì)胞變形指數(shù)，降低紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞壓積，這與各炮制品能夠降低全血黏度和血漿黏度等宏觀指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果相呼應(yīng)，二者共同體現(xiàn)了水蛭各炮制品改善血液流變學(xué)的作用。PT、APTT、TT分別反映的是血液凝固的外源性途徑、內(nèi)源性途徑和共同途徑[11]。水蛭吊干品、酒潤(rùn)麩制品均未顯著延長(zhǎng)急性血瘀模型大鼠的PT，表明其對(duì)PT的影響并不明顯，但兩者高劑量均可有效延長(zhǎng)TT，同時(shí)水蛭經(jīng)過滑石粉燙制后，高劑量可顯著延長(zhǎng)大鼠的PT、APTT和TT，分析原因可能為水蛭經(jīng)過高溫、乙醇等處理后，蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生變性，在體內(nèi)更加容易被酶解消化，從而更好地發(fā)揮療效。

血液流變學(xué)系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)的變化機(jī)制往往是互相關(guān)聯(lián)的，血液黏度降低、流動(dòng)性改善的同時(shí)，其凝固時(shí)間也會(huì)相應(yīng)的延長(zhǎng)，這也體現(xiàn)了活血化瘀藥物的作用特點(diǎn)[18-19]。由本研究結(jié)果可以看出，與模型組比較，水蛭吊干品在降低全血黏度和血漿黏度、改善血液流動(dòng)性的同時(shí)，能夠延長(zhǎng)血液凝固時(shí)間，水蛭經(jīng)滑石粉燙制和酒潤(rùn)麩制后，其血液流變學(xué)指標(biāo)也有相應(yīng)的改善，凝固時(shí)間也有相應(yīng)的延長(zhǎng)，以上結(jié)果均與血液流變學(xué)系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的相關(guān)性這一結(jié)論相吻合。

近年來許多研究均表明，經(jīng)過滑石粉燙制、酒潤(rùn)麩制后，水蛭的體外抗凝作用減弱[20-21]，主要是由于其體外檢測(cè)的是水蛭大分子蛋白的抗凝活性[22]。由于在炮制過程中受到高溫、有機(jī)溶劑等作用，水蛭中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，提取時(shí)蛋白溶出度大大降低，致使體外抗凝活性減弱。而水蛭經(jīng)過口服后，在胃腸道內(nèi)被分解為小分子肽類物質(zhì)，吸收入血發(fā)揮療效[23]。經(jīng)過高溫炮制后的水蛭蛋白質(zhì)發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)變得疏松，更加容易被胃腸道中的蛋白酶酶解，因此其在體內(nèi)具有良好的抗凝和改善血液流變學(xué)的作用。

中藥雖然存在一定的量效關(guān)系，但是這種量效關(guān)系受動(dòng)物反應(yīng)性、成分復(fù)雜性等諸多因素的影響，故可能存在中、低劑量比高劑量效果更好的情況，這也是本研究有待進(jìn)一步驗(yàn)證之處。但總體而言，水蛭吊干品、滑石粉燙制品、酒潤(rùn)麩制品均能夠有效改善急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)、延長(zhǎng)凝血時(shí)間，具有良好的活血化瘀活性。

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（收稿日期：2020-03-23 修回日期：2020-07-07）

（編輯：鄒麗娟）