周姣姣 何正春 夏從龍 張成桂 劉湘 劉光明

摘 要 目的：研究美洲大蠊提取物CⅡ-3與其體外抗肝癌活性的譜效關(guān)系，并初步明確其抗肝癌活性成分。方法：在已建立10批CⅡ-3樣品的超高效液相色譜（UHPLC）指紋圖譜的基礎(chǔ)上，借助超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法（UHPLC-Q-TOF/MS），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)文獻(xiàn)定性鑒定各色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物;以各批CⅡ-3樣品對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的半數(shù)抑制濃度（IC50）為抗肝癌活性指標(biāo)，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法（GRA）與正交偏最小二乘法（OPLS）建立并分析指紋圖譜與抗肝癌活性之間的譜效關(guān)系。結(jié)果：10批CⅡ-3樣品的UHPLC指紋譜圖中有共有峰25個(gè)，指認(rèn)出其中10個(gè)，分別為環(huán)（酪氨酸-脯氨酸）（峰24）、環(huán)（甘氨酸-苯丙氨酸）（峰15）、次黃嘌呤（峰3）、腺嘌呤（峰7）、苯丙氨酸（峰10）、肌苷（峰11）、N-乙酰多巴胺（峰16）、環(huán)（脯氨酸-丙氨酸）（峰13）、2-羥基馬尿酸（峰22）、環(huán)（脯氨酸-絲氨酸）（峰6）。10批CⅡ-3樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為70.550～200.303 μg/mL。25個(gè)共有峰中，以抗肝癌活性的GRA分析關(guān)聯(lián)度（r）排序?yàn)榉?0>23>24>15，且其r值均大于0.7;以O(shè)PLS分析變量重要性投影（VIP）值排序?yàn)榉?3>18>15>24>7>14>6>2>20，且VIP值均大于1，其中峰7、15、20、23、24的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)均大于0，峰2、6、14、18的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)均小于0。聯(lián)合分析顯示，CⅡ-3樣品抗肝癌活性主要成分依次為峰20>23>24>15。結(jié)論：CⅡ-3中兩個(gè)未知化合物（峰20、23）和環(huán)（酪氨酸-脯氨酸）（峰24）、環(huán)（甘氨酸-苯丙氨酸）（峰15）可能是其抗肝癌活性的主要成分。

關(guān)鍵詞 美洲大蠊;抗肝癌作用;灰色關(guān)聯(lián)度法;正交偏最小二乘法;譜效關(guān)系;超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the spectrum-effect relationship of anti-hepatoma effect of CⅡ-3 extract from Periplaneta americana， and to preliminarily clarify the anti-hepatoma active components of it. METHODS： Based on UHPLC fingerprints of 10 batches of CⅡ-3 samples， with the help of UHPLC-Q-TOF/MS， the compounds corresponding to each chromatographic? peak were identified qualitatively by standard substances and related literatures. Using the IC50 value of each batch of CⅡ-3 sample against human hepatoma cells HepG2 as anti-hepatoma activity index， the spectrum-effect relationship of fingerprint and anti-hepatoma effect was established and analyzed by the combination of grey relational analysis （GRA） and orthogonal partial least squares （OPLS）.? RESULTS： There were 25 common peaks in UHPLC fingerprints of 10 batches of? ? CⅡ-3 samples， and 10 chemical compounds were identified， which were cyclo-（Tyr-Pro） （peak 24），cyclo-（Gly-Phe） （peak 15），hypoxanthine （peak 3），adenine （peak 7），phenylalanine （peak 10），inosine （peak 11），N-acetyldopamine （peak 16），cyclo-（Pro-Ala） （peak 13），2-hydroxy propionyl （peak 22），cyclo-（Pro-Ser） （peak 6）. The IC50 of 10 batches of CⅡ-3 samples to HepG2 cells was 70.550-200.303 μg/mL. Among 25 common peaks， the order of GRA correlation （r） of anti-hepatoma activity was peak 20>23>24>15， all of r values were greater than 0.7; the order of variable importance projection （VIP） of OPLS analysis was peak 23>18>15>24>7>14>6>2>20， all of VIP values were greater than 1. The standard regression coefficients of peak 7， 15， 20， 23， 24 were all greater than 0; while the standard regression coefficients of peak 2， 6， 14， 18 were all less than 0. Conjoint analysis shows that the order of anti-hepatoma activity was peak 20>23>24>15. CONCLUSIONS： unknown chemical ingredients（peak 20， 23），cyclo-（Tyr-Pro）（peak 24） and cyclo-（Gly-Phe）（peak 15） in CⅡ-3 may be main anti-hepatoma active components.

KEYWORDS? ?Periplaneta american; Anti-hepatoma effect; Grey relational analysis;? Orthogonal partial least squares; Spectrum-effect relationship; UHPLC-Q-TOF/MS

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）為蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，俗稱蟑螂。其藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主治“小兒疽積、癥瘕積聚和瘡癰腫毒”[1]。近年來(lái)，美洲大蠊的藥用價(jià)值得到學(xué)者的廣泛認(rèn)同，大量研究表明其具有明顯的促進(jìn)組織修復(fù)再生、抗氧化、抗腫瘤、抗肝炎和免疫調(diào)節(jié)等功效[2-5]。本課題組前期研究表明，以美洲大蠊提取物CⅡ-3為原料的美蠊精膠囊具有顯著的抗肝癌作用[6-7]，并建立了10批CⅡ-3樣品的指紋圖譜[8]。但其抗肝癌的活性成分尚未明確，且缺乏藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面的相關(guān)研究。為此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法（UHPLC-Q-TOF/MS），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)和文獻(xiàn)檢索對(duì)CⅡ-3所含化合物進(jìn)行分析鑒定;以CⅡ-3對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的半抑制濃度（IC50）為抗肝癌活性指標(biāo)，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法（GRA）和正交偏最小二乘法（OPLS）聯(lián)合建立指紋圖譜與抗肝癌活性之間的譜效關(guān)系，旨在為美洲大蠊提取物CⅡ-3的抗肝癌物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UITiMate 3000型UHPLC儀（美國(guó)Thermo? Fisher Scientific公司）;MALDI-TOF MS系統(tǒng)（德國(guó)Bruker公司）;FDU-2100型冷凍干燥機(jī)（昆明倍捷科技有限公司）;SB25-12D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];NU-5510E 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)NuAire公司）;SN255939型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）;DT5-6型臺(tái)式低速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）;DW-86L388型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）;ES-315型高壓滅菌鍋（日本Tomy Digital Biology公司）;WTE-PW8-5012型超級(jí)純水機(jī)（格力電器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

美洲大蠊提取物CⅡ-3由大理大學(xué)藥化學(xué)院劉光明教授提供（編號(hào)：S1～S10，每克CⅡ-3樣品相當(dāng)于100 g干燥的美洲大蠊）;肌苷標(biāo)準(zhǔn)品和次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：NUAD-SQW2、B96L-VFAP，純度均大于98%）;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）;噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，天津市福晨化學(xué)試劑廠）;乙腈（德國(guó)Merck公司，色譜純）;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

人肝癌HepG2細(xì)胞株由齊氏生物科技有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 CⅡ-3樣品體外抗肝癌試驗(yàn)

2.1.1 樣品制備 分別精密稱取10批CⅡ-3樣品各6.00 mg，溶于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）10 mL中，得到質(zhì)量濃度為600.00 ?g/mL的母液，再用完全培養(yǎng)基稀釋成400.00、300.00、200.00、100.00、50.00 ?g/mL等5個(gè)質(zhì)量濃度的CⅡ-3溶液，備用。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞（培養(yǎng)條件下同）。培養(yǎng)過(guò)程中，1～2 d換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，3～4 d傳一代細(xì)胞。

2.1.3 CⅡ-3樣品對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105 個(gè)/mL，按100 ?L/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入“2.1.1”項(xiàng)下5個(gè)質(zhì)量濃度的CⅡ-3溶液（給藥濃度依據(jù)前期試驗(yàn)設(shè)置），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（不含細(xì)胞、不含藥物）和溶劑對(duì)照組（不含藥物、只含細(xì)胞），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS清洗2次，再加入MTT溶液20 ?L，輕輕拍勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔添加DMSO 150 ?L，低速振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算CⅡ-3樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=（溶劑對(duì)照組吸光度-給藥組吸光度）/（溶劑對(duì)照組吸光度-空白對(duì)照組吸光度）×100%。

2.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2003進(jìn)行線性回歸分析，通過(guò)回歸方程預(yù)測(cè)10批CⅡ-3樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，各批CⅡ-3樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為70.550～200.303 μg/mL。

2.2 CⅡ-3樣品的化學(xué)成分分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18 110A（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0.0～11.0 min，1.0%A→3.5%A;11.0～37.3 min，3.5%A→8.0%A;37.3～90.0 min，8.0%A→22.0%A;90.0～104.0 min，22.0%A→28.0%A;流速：0.5 mL/min;柱溫：28 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm;進(jìn)樣量：8 ?L。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI）以正、負(fù)離子兩種模式分別進(jìn)行檢測(cè);掃描范圍：m/z 50～1 200，以甲酸鈉進(jìn)行質(zhì)量實(shí)時(shí)矯正;噴霧氣體和干燥氣體均為高純度氮?dú)?碰撞氣體：氬氣;離子噴霧電壓：4 500 V;檢測(cè)電壓：2 000 V;脫溶劑氣溫度：180 ℃;錐孔氣流量：8.0 mL/min;離子源溫度：200 ℃。

2.2.3 UHPLC指紋圖譜生成和共有峰指認(rèn) 按本課題組前期已建立的指紋圖譜研究方法，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)10批CⅡ-3樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析。相關(guān)方法學(xué)考察內(nèi)容見(jiàn)已發(fā)表文獻(xiàn)[8]。10批CⅡ-3樣品的UHPLC指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖1，CⅡ-3樣品在正、負(fù)離子模式下的基峰離子流圖見(jiàn)圖2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)文獻(xiàn)[9-15]定性鑒定出10個(gè)化合物，結(jié)果見(jiàn)表2。從圖1和表2可知，CⅡ-3的指紋圖譜中有25個(gè)共有峰，其中峰7、10、11、15分別為腺嘌呤、苯丙氨酸、肌苷、環(huán)（甘氨酸-苯丙氨酸），由于其峰面積相對(duì)較大，推測(cè)均為CⅡ-3樣品的主要成分。

2.3 CⅡ-3樣品譜效關(guān)系的建立

2.3.1 GRA 以UHPLC指紋圖譜的共有峰峰面積為比較序列，以CⅡ-3樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為參考序列，采用均值化法對(duì)上述序列數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理;數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，比較序列記為{Xi（m）}，參考序列記為{X0（m）}，計(jì)算關(guān)聯(lián)度（r）。r值越大，表明該色譜峰對(duì)藥理活性影響越大[16]。CⅡ-3的25個(gè)共有峰中，以r值排序，峰20、23、24、15對(duì)CⅡ-3樣品的抗肝癌活性貢獻(xiàn)較大，r均大于0.7;峰21、17、3、7、10、1、11、16、13、19、25、8、9、22的貢獻(xiàn)次之，r大于0.6且小于0.7;峰5、14、2、4、12、6、18的貢獻(xiàn)較小，r均小于0.6，詳見(jiàn)表3。

2.3.2 OPLS分析 以UHPLC指紋圖譜的共有峰峰面積為自變量，以CⅡ-3樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為因變量，將峰面積做歸一化處理后導(dǎo)入Simca 13.0軟件中，計(jì)算25個(gè)共有峰與IC50（藥效）的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)和變量重要性投影（VIP），結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3B可知，以VIP值排序，峰23、18、15、24、7、14、6、2、20的VIP值均大于1，說(shuō)明這些峰對(duì)CⅡ-3樣品的抗肝癌活性有重要影響。結(jié)合圖3A可知，在VIP大于1的色譜峰中，峰23、15、24、7、20的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)大于0，其與CⅡ-3樣品的抗肝癌活性成正相關(guān)，峰18、14、6、2的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)小于0，兩者成負(fù)相關(guān)。

2.3.3 GRA和OPLS的聯(lián)合分析 將r>0.7和VIP>1的峰整合，發(fā)現(xiàn)CⅡ-3樣品抗肝癌活性的主要成分依次為峰20（未知化合物）>23（未知化合物）>24[環(huán)（酪氨酸-脯氨酸）]>15[環(huán)（甘氨酸-苯丙氨酸）]，且均與藥理活性成正相關(guān)。

3 討論

有研究表明，以美洲大蠊為原料制得的美蠊精膠囊等藥品的藥理活性顯著且臨床應(yīng)用廣泛[7-8]，但其化學(xué)成分研究較為薄弱，尚未找到特異性的活性物質(zhì)，亦無(wú)其真正發(fā)揮臨床療效活性物質(zhì)的相關(guān)報(bào)道?；诖耍菊n題組結(jié)合前期UHPLC指紋圖譜，采用UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)在正、負(fù)離子模式下對(duì)10批美洲大蠊提取物CⅡ-3進(jìn)行整體分析，共得25個(gè)共有峰并鑒定出10個(gè)化合物，多為環(huán)二肽類和核苷類成分。據(jù)報(bào)道，環(huán)二肽類是具有抗癌、抑菌、抗凝和抗氧化等作用的一類活性物質(zhì)[17-19]，核苷類物質(zhì)多具有抗病毒、抗腫瘤和肝損傷修復(fù)等作用[20]?？梢?jiàn)，美洲大蠊提取物CⅡ-3的抗肝癌作用可能與這兩類物質(zhì)緊密相關(guān)。

GRA法常用于預(yù)測(cè)中藥或復(fù)方中各成分與藥效的相關(guān)性，具有對(duì)樣本容量和數(shù)據(jù)分布規(guī)律要求低、計(jì)算簡(jiǎn)便且易程序化的特點(diǎn)[21]。但該方法計(jì)算出的關(guān)聯(lián)度只具有相對(duì)意義，只能反映化合物與藥效間相關(guān)性的大小，不能判斷出正負(fù)關(guān)聯(lián)，而OPLS法則可彌補(bǔ)GRA法的這一不足[22]。因此，本研究采用兩種方法聯(lián)合分析CⅡ-3與抗肝癌活性之間的譜效關(guān)系。結(jié)果表明，25個(gè)共有峰中有18個(gè)特征峰與CⅡ-3樣品抗肝癌活性的r值大于0.6，證明其具有相關(guān)性。但所有峰的r值均未超過(guò)0.8，表明其相關(guān)性不顯著。其中，峰20、23、24、15的r值大于0.7、VIP值大于1且標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)均大于0，說(shuō)明其對(duì)藥效貢獻(xiàn)相對(duì)較大并成正相關(guān)。曾瑤波等[23]研究表明，環(huán)（酪氨酸-脯氨酸）（峰24）有良好的抗肝癌活性，可能是CⅡ-3抗肝癌的活性成分。

綜上所述，本研究通過(guò)譜效分析初步闡明了美洲大蠊提取物CⅡ-3體外抗肝癌的活性物質(zhì)，為該藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為以美洲大蠊為原料的相關(guān)藥品或有效部位的化學(xué)成分及作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了參考。

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（收稿日期：2020-04-04 修回日期：2020-07-03）

（編輯：鄒麗娟）