蔣 靚，張光波，謝金晶，李維潔，湯龍海

（蘇州市中心血站檢驗科，江蘇215006）

血小板輸注已成為現(xiàn)代輸血醫(yī)學的主要內(nèi)容之一，在白血病、DIC 等血液系統(tǒng)疾病的治療中發(fā)揮重要作用，而輸注前血小板的活化狀態(tài)直接影響臨床效果。研究表明，使用血細胞分離機（Trima）制備的單采血小板穩(wěn)定性好、活化水平最低，因此得到廣泛使用[1]。有較多的研究表明，高脂血癥患者血漿中低密度脂蛋白（LDL）水平升高易促進血小板活化聚集，引起動脈粥樣硬化和炎癥反應[2-3]。本實驗旨在探究單采血小板血漿中高水平LDL 是否對不同保存時間下血小板活化指標 CD63、CD36、CD40 及 CD62p 表達產(chǎn)生影響，為臨床血小板輸注提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 一般資料 蘇州市中心血站2019 年4 月—6月無償捐獻單采血小板供者35 名，均男性，年齡為25～40 歲，平均31 歲，符合國家規(guī)定的獻血者體檢標準。同時滿足以下要求：采前外周靜脈血血小板達到（150～449）×109/L；2 次采集間隔時間≥14 天；采集前72 h 內(nèi)未服用阿司匹林類藥物。根據(jù)捐獻者低密度脂蛋白水平分為升高組（LDL≥3.4 mmol/L）5 例（范圍 3.47～5.14 mmol/L，中位數(shù) 3.9 mmol/L）和正常組（LDL＜3.4 mmol/L）30 例（范圍 0.32～3.37 mmol/L，中位數(shù)0.925 mmol/L）。本研究經(jīng)本血站倫理委員會審批，所有獻血者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集和保存血小板：由血細胞分離機經(jīng)LDPLP 程序以濾白法采集血小板。血小板采集設定量為≥2.5×1011/袋，容量設定為 250～300 mL，同時進行血小板質(zhì)控檢測，質(zhì)量符合單采血小板國家質(zhì)量標準。利用單采血小板的留樣袋，每份留取血小板10 mL，置于（22±2）℃水平振搖血小板保存箱保存，分別于第2、3、4、5 天留取標本進行檢測，并取出部分標本使用小留樣袋或EP 管分裝，于室溫下靜置，然后于0 min、30 min、60 min、120 min 各時間點上流式細胞儀檢測血小板活化指標。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測血小板活化指標：用磷酸鹽緩沖液調(diào)整血小板濃度為（1～3）×109/L 血小板懸液，吸取 20 μL 血小板懸液與 CD63-FITC、CD36-PE、CD40-FITC、CD62p-PE 熒光抗體（Biolegend，達科為生物技術(shù)有限公司，上海）室溫下避光孵育15 min，加入1 mL 4%多聚甲醛固定，流式細胞儀（Beckman Coulter，F(xiàn)C500，美國）檢測熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用EXCEL 軟件和SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。血小板活化指標檢測數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，兩組間比較采用非參數(shù)Wilcoxon 檢驗，多組間比較采用Friedman 檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 血小板活化指標的表達 與同型對照組相比，LDL 正常組及升高組血小板均有不同程度CD63、CD36、CD40、CD62p 表達（圖 1）。

圖1 血小板表面表達CD63、CD36、CD40 和CD62p

2.2 不同保存時間兩組血小板活化指標表達率比較 在不同保存時間下，LDL 升高組血小板CD63、CD36、CD40 及 CD62p 的表達率與 LDL 正常組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同保存時間兩組血小板活性指標表達率比較（%）

2.3 不同室溫靜置時間下兩組血小板活化指標表達率比較 由于血小板臨床輸注在室溫下進行，因而需要比較不同保存時間的血小板室溫靜置0 min、30 min、60 min、120 min 時活化指標表達率，結(jié)果顯示保存第2、3、4、5 天的血小板經(jīng)室溫不同靜置時間，LDL 升高組與 LDL 正常組比較，CD63、CD36、CD40 以及CD62p 表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2、表 3、表 4、表 5。

表2 兩組保存第2 天血小板經(jīng)室溫不同靜置時間后活性指標表達率比較（%）

表3 兩組保存第3 天血小板經(jīng)室溫不同靜置時間后活性指標表達率比較（%）

表4 兩組保存第4 天血小板經(jīng)室溫不同靜置時間后活性指標表達率比較（%）

表5 兩組保存第5 天血小板經(jīng)室溫不同靜置時間后活性指標表達率比較（%）

3 討 論

高脂血癥表現(xiàn)為高膽固醇和/或高甘油三酯，與心腦血管疾病和血栓性疾病發(fā)生有關(guān)。有研究指出，高膽固醇血癥會致使血小板壽命縮短，且黏附、聚集以及釋放反應增強[4]。莊愛周等[5]探討總膽固醇和三酰甘油對血小板各參數(shù)的影響，指出不論是血脂單項升高或者混合升高，均可顯著改變PLT 數(shù)和血小板平均體積（MPV），提示在高脂血癥環(huán)境下血小板易被激活。研究表明，高膽固醇血癥通過血小板ADP受體-P2Y12 途徑促進血小板活化[6-7]。LDL 作為心血管疾病的危險性因素在血小板活化中的作用及具體機制尚未明確。隨著分子生物學和免疫學的發(fā)展，對血小板表面活化標志物進行了廣泛研究。血小板表面 CD63、CD36、CD40 和 CD62p 均可作為血小板活化標志物[8-10]，其中CD62p 是血小板活化過程中釋放最多的顆粒膜糖蛋白，能夠準確反映血小板活化程度。陳樂聞[6]研究顯示，高LDL-C 患者血小板CD62p和PAC-1 的表達顯著升高，經(jīng)他汀類藥物治療后CD62p 和PAC-1 的表達顯著降低，反映高LDL-C 能激活血小板的活化聚集功能。吳延慶等[11]不僅在體內(nèi)觀察到血漿LDL-C 與血小板膜PAC-1 及CD40L 表達存在線性相關(guān)，而且在體外也發(fā)現(xiàn)高LDL-C 血漿與血小板孵育可顯著增加血小板膜PAC-1 及CD40L 表達水平，表明高LDL-C 水平與血小板的免疫活化有關(guān)。但迄今為止尚未有針對單采血小板血液標本LDL 升高對血小板免疫活化影響的研究。

本血站單采血小板年供應約35 000 個治療量，由于血小板保存期短，易被激活，所以血小板制備、保存與活化的問題備受關(guān)注[2]。體外血小板活化狀態(tài)直接關(guān)系患者的臨床輸注效果。目前獻血者初篩檢測指標未涉及血脂4 項，對于血脂濃度升高者對血小板的影響尚不清晰。本研究對單采血小板血液標本中LDL 水平與血小板各活化指標的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示正常獻血員血小板標本均有CD63、CD36、CD40 和CD62p 的表達，在保存期內(nèi)血小板的活化狀態(tài)未受影響。在同一保存條件下的不同保存時間內(nèi)，LDL 升高組血小板各活化標志物的表達水平與LDL 正常組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由于健康獻血員中LDL 水平升高者的比例低，且LDL 多屬于邊緣升高，與臨床高脂血癥患者LDL 的異常升高水平不同，尚不足以有效激發(fā)血小板免疫活化，從而不會影響臨床輸注效果。有研究表明，高濃度LDL 能顯著增加ADP 激活的血小板表面PAC-1 及CD40L 的表達，促進血小板的聚集，推測LDL 可能通過增強血小板激活劑間接促進血小板在某些特定條件下的活化[11]。高脂血癥患者可能伴有氧化修飾型LDL（OX-LDL）及某些炎癥介質(zhì)水平的升高，兩者能直接刺激血小板活化，從而介導動脈粥樣硬化炎癥的發(fā)生[11-15]。而正常獻血者體內(nèi)免疫系統(tǒng)正常，不存在炎癥介質(zhì)等應激狀態(tài)，即便血漿LDL 水平些許升高，但是OX-LDL 水平正常，因而不會對血小板免疫活化產(chǎn)生影響。另外，臨床高脂血癥患者需空腹抽取血液標本進行血脂的檢測，而無償獻血者不能空腹抽取血液標本，因此其LDL 水平還與獻血前飲食有關(guān)。

綜上所述，在不同保存時間內(nèi)單采血小板獻血員血漿LDL 水平與血小板免疫活化無關(guān)，高LDL 水平不影響血小板的活化狀態(tài)，從而不影響臨床輸注效果。今后我們將繼續(xù)擴大單采血小板LDL 水平升高組的樣本量，并進行體外實驗，研究在炎癥介質(zhì)、ADP 等激活劑的作用下血漿LDL 升高對血小板活化的影響。