許春蕾 李 娜 湯旭山

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在男性中位于第3位，在女性中位于第4位[1]。近年來，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率正逐年上升，并且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢[2]。但由于結(jié)腸癌早期發(fā)病隱匿及臨床癥狀不典型等特點(diǎn)導(dǎo)致其早期診斷與治療仍進(jìn)展有限[3]。隨著腫瘤生物學(xué)的發(fā)展，人們迫切希望從基因、分子層面探索結(jié)腸癌的病因及發(fā)生機(jī)制以改善患者的預(yù)后。

MircoRNAs(miRNAs)屬于內(nèi)源性短鏈RNA,其能夠與目標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)的互補(bǔ)位點(diǎn)特異性結(jié)合并抑制其翻譯或者促進(jìn)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。文獻(xiàn)曾報道多種miRNA在結(jié)腸癌中表達(dá)異常[4]，如過表達(dá)的miR-17-5p可以通過下調(diào)E2F1的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[5]，miR-145可以通過靶向調(diào)節(jié)MAPK來抑制腫瘤細(xì)胞的生長從而起到抑癌作用[6]。最近Kandhavelu,J[7]團(tuán)隊對結(jié)腸癌患者的腫瘤組織和血清進(jìn)行大規(guī)模miRNA的篩選，結(jié)果提示miR-96-5p在結(jié)腸癌患者中異常高表達(dá)，推測其可能是結(jié)腸癌標(biāo)志基因的潛在靶點(diǎn)之一。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于miR-96-5p對結(jié)腸癌的作用鮮有報道，故本研究預(yù)通過實(shí)驗明確miR-96-5p對結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展的影響及其相關(guān)作用機(jī)制，為全面闡明miRNA-96-5p在結(jié)腸癌中的作用奠定基礎(chǔ)，為結(jié)腸癌的早期診斷及臨床治療提供新的思路和實(shí)驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；30只SPF級BALB/c免疫缺陷型雌性裸鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心，4～6周齡，體重(15.6±2.4)g；本實(shí)驗的所有操作均通過動物倫理學(xué)審批。胎牛血清(FBS)、DMEM/F12(Hyclone公司)，Trizol、Lipo 2000、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(Invitrogen公司)，Pcmv質(zhì)粒、miR-96-5p mimics/inhibitor及無關(guān)核酸序列(上海吉瑪)、Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(北京博奧生物科技公司)，Matrigel膠(BD公司)，MTT試劑盒(Sigma公司)，Transwell小室(Millipore公司)、雙熒光酶檢測試劑盒(Promega公司)、MTSS1抗體、GAPDH抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含有10%FBS的DMEM/F12將HCT116細(xì)胞置于37 ℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至70%～80%時用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，室溫下800 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml，取1 ml細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板上，同上條件于培養(yǎng)箱中過夜，觀察待細(xì)胞充分貼壁后，去除培養(yǎng)基，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。按照 Lipo2000試劑使用說明書分別將miR-96-5p inhibitor及microRNA無關(guān)序列(即miR-NC)按終濃度50 nmol/l轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞內(nèi)，同上條件于培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，4 h后更換為含有15%FBS的DMEM/F12，并用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，拍照記錄。后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR) 按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，再按照SYBR Mixture說明書及預(yù)實(shí)驗確定的時間與溫度進(jìn)行實(shí)時定量。RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃(10 min)預(yù)變性后，變性95 ℃(5 s)→退火60 ℃(30 s)→72 ℃(32 s)，40個循環(huán)。RT-PCR引物設(shè)計為：miR-96-5p上游為5'-ACA CTC CAG CTG GGT TTG GCA CTA GCA CAT TT-3'，下游為5' CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG AGC AAA AA 3'；GAPDH上游為5' AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG 3'，下游為5' AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC 3'；MTSS1上游為：5' AGCAGCCTGAACAGTGTCAA 3'，下游為：5' GGGATGGTGACTTGGACTGG 3'。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct方法進(jìn)行計算分析。以上實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 MTT實(shí)驗 取轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至5×103個/ml，接種至96孔板中，每孔含200 μl 10%胎牛血清DMEN/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后取出細(xì)胞，加入20 μl MTT(5 mg/ml)/孔，37 ℃孵育4 h，棄除原培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)/孔，于室溫下充分震蕩10 min使形成的紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解。置酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長測定每孔吸光度值(OD)。根據(jù)公式：(對照組OD-實(shí)驗組OD)/對照組OD，計算并分析各組的細(xì)胞增殖率。每組設(shè)定5個復(fù)孔，實(shí)驗單獨(dú)重復(fù) 3次。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗 預(yù)先在6孔板每個孔的底部使用marker筆劃2條間隔為5 mm的橫線，再將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2 ml含10%的細(xì)胞培養(yǎng)液并使每孔細(xì)胞達(dá)2×105個，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時使用200 μl移液器槍頭在細(xì)胞培養(yǎng)面垂直于marker筆劃線，PBS沖洗細(xì)胞3次以去除刮除掉的細(xì)胞。再向每孔加入含2%FBS的DMEN/F12培養(yǎng)液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下照相，使用Image J軟件測量細(xì)胞間距離進(jìn)行分析。

1.2.5 Transwell實(shí)驗 用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12稀釋Matrigel基質(zhì)膠(1∶6)包被Transwell小室中的上室基底膜，加入100 μl含1%FBS的DMEM/F12細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度使每孔細(xì)胞達(dá)2×105個。在Transwell小室下層加入含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，取出小室用濕棉簽輕輕擦拭上室基底部以去除上室殘存細(xì)胞，PBS沖洗2次，無水酒精于室溫下固定15 min，0.1%結(jié)晶紫室溫下染色半小時，晾干后于倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照，每組隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取其平均值為穿出細(xì)胞數(shù)。以上實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 凋亡實(shí)驗 將轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，用0.25%的胰酶進(jìn)行常規(guī)消化，PBS洗滌3次，800 r/min離心5 min后棄去上清液，調(diào)整細(xì)胞濃度使每樣本量細(xì)胞約為5×105，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸，隨后加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，室溫下避光孵育30 min，隨后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。以上實(shí)驗單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.7 裸鼠致瘤實(shí)驗 取處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞接種至直徑為5 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。根據(jù)Lipo2000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，利用pCMV質(zhì)粒將miR-96-5p的過表達(dá)及抑制表達(dá)的microRNA轉(zhuǎn)染入HCT116細(xì)胞內(nèi)。本實(shí)驗分為miR-96-5p過表達(dá)組，即 pCMV-miR-96-5p-mimics；miR-96-5p抑制組，即 pCMV-miR-96-5p-inhibitor；對照組為空載體轉(zhuǎn)染的HCT116，即NC組。常規(guī)消化細(xì)胞后，用無血清DMEN/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至4×106/ml。選取4周齡的BALB/c小鼠，于每只裸鼠右上肢腋下接種轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞懸液200 μl;接種6周后脫頸處死荷瘤小鼠，計算腫瘤體積(腫瘤體積=腫瘤最短徑2×腫瘤最長徑/2)并稱重。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測 利用miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan(http://www.targetscan.org/),miRanda(http://www.microrna.org)對miR-96-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，篩選MTSS1作為其可能的靶分子。以人結(jié)腸癌細(xì)胞基因組DNA為模板，首先構(gòu)建MTSS1的野生型(wt)和突變型(mut)質(zhì)粒。利用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計，擴(kuò)增與miR-96-5p靶向序列相結(jié)合的MTSS1的3'-UTR片段。擴(kuò)增產(chǎn)物在經(jīng)過純化、酶切和連接過程后導(dǎo)入雙熒光素酶真核表達(dá)載體pmirGLO中，構(gòu)建出野生型表達(dá)質(zhì)粒。用TaKaRa點(diǎn)突變試劑盒擴(kuò)增突變片段，隨后構(gòu)建MTSS1突變型表達(dá)質(zhì)粒。取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，接種于96孔板上，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個/孔，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，利用Lipo2000按pmirGLO-MTSS1-wt+miRNA-96-5p 模擬物轉(zhuǎn)染組、pmirGLO-MTSS1-wt+miRNA-96-5p 對照模擬基因組、pmirGLO-MTSS1-mut+miRNA-96-5p 模擬物轉(zhuǎn)染組、pmirGLO-MTSS1-mut+miRNA-96-5p對照模擬基因組進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，每組設(shè)5個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后，依次加入螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶檢測試劑，利用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行分析。

1.2.9 Westernblot實(shí)驗 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，使蛋白分離，后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h，將PVDF膜與稀釋后的抗MTSS1(1∶200)，GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃條件下封閉過夜，再以 TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育1 h，以 TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后加入顯色劑，ECL發(fā)光。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為其相對含量。以上實(shí)驗重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-96-5p對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

熒光顯微鏡觀察結(jié)果提示，HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染率約為85%。利用RT-PCR檢測miR-96-5p表達(dá)，結(jié)果提示與正常對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-96-5p inhibitor的HCT116細(xì)胞內(nèi)miR-96-5p的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，轉(zhuǎn)染microRNA無關(guān)序列組(miR-NC)的細(xì)胞內(nèi)miR-96-5p的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。MTT實(shí)驗結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miR-96-5p inhibitor后的HCT116細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05)。見圖1。

注：A、B：白光下及熒光下HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(×200)；C：各組細(xì)胞中miR-96-5p的表達(dá)；D：各組細(xì)胞增殖能力的變化曲線。與miR-NC組比較：*P<0.05。與正常對照組比較：## P<0.01。

2.2 miR-96-5p對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、浸潤及凋亡的影響

劃痕實(shí)驗提示轉(zhuǎn)染miR-96-5p inhibitor后的HCT116細(xì)胞遷移能力明顯下降(P<0.05)，見圖2A、B；Transwell 實(shí)驗結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miR-96-5p inhibitor后的HCT116細(xì)胞浸潤能力顯著下降(P<0.05)，見圖2C、D；凋亡實(shí)驗提示轉(zhuǎn)染miR-96-5p inhibitor后細(xì)胞凋亡明顯升高(P<0.01)，見圖2E、F。

注：A:各組細(xì)胞遷移距離(×200)；B：各組細(xì)胞遷移結(jié)果分析；C：各組細(xì)胞浸潤細(xì)胞數(shù)(×200)D：各組細(xì)胞侵襲結(jié)果分析的變化；E：各組細(xì)胞凋亡的流式結(jié)果；F：各組細(xì)胞凋亡結(jié)果分析。與miR-NC組比較：*P<0.05，**P<0.01。

2.3 miR-96-5p對裸鼠皮下成瘤的影響

3組BALB/c小鼠經(jīng)處理6周后，測量腫瘤體積與腫瘤重量結(jié)果提示與對照組(即NC組)相比，miR-96-5p 過表達(dá)組(即Pcmv-miR-96-5p mimics組)裸鼠的腫瘤體積顯著增大(P<0.05)，腫瘤的重量也明顯增加(P<0.05)；而miR-96-5p抑制組(即Pcmv-miR-96-5p inhibitor)裸鼠腫瘤的體積均明顯較小(P<0.01)，腫瘤的重量也明顯減輕(P<0.01)。見圖3。

注：A：各組小鼠的腫瘤生長情況；B：各組小鼠腫瘤的體積比較；C：各組小鼠的腫瘤重量比較。與NC組比較：*P<0.05，**P<0.01。

2.4 miR-96-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞中與MTSS1之間的相互關(guān)系

miRNA靶基因預(yù)測軟件提示MTSS1可能為miR-96-5p的目標(biāo)基因，見圖4A；雙熒光素酶報告基因結(jié)果提示與對照模擬基因組相比，MTSS1-wt組熒光酶活性降低(P<0.05)，見圖4B；進(jìn)一步利用Westernblot實(shí)驗提示miR-96-5p可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控MTSS1的表達(dá)，見圖4C、D。

注：A：miRNA靶基因預(yù)測軟件結(jié)果；B：雙熒光素酶報告基因結(jié)果分析；C、D：Westernblot結(jié)果及分析。與miR-NC組比較： **P<0.01；與對照模擬基因組比較：#P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌作為消化道常見惡性腫瘤，因其早期癥狀不典型，導(dǎo)致50%的結(jié)腸癌患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)發(fā)生了其他臟器或組織的轉(zhuǎn)移，而超過1/3的患者在手術(shù)治療后將會復(fù)發(fā)[8]，故結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制及早期診斷的靶標(biāo)也一直是科學(xué)家與臨床醫(yī)生研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)問題。越來越多的證據(jù)提示miRNAs可以通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞浸潤、增殖與凋亡等惡性生物行為的相關(guān)的靶基因，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移[9]。Wu等[10]曾報道m(xù)iR-96在膀胱癌癌組織中高表達(dá)，且體外實(shí)驗提示過表達(dá)的miR-96可以通過抑制CDKN1A蛋白的翻譯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，從而推測miR-96可能是乳腺癌中的促癌miRNA。吳昊團(tuán)隊[11]通過實(shí)驗提示肺癌患者血清與腫瘤組織中高表達(dá)miR-96，進(jìn)一步實(shí)驗提示miR-96可以通過阻礙抑癌基因LMO7的作用從而發(fā)揮促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與遷移能力并抵抗抗癌藥物順鉑的作用。而在胰腺癌中，miR-96可以通過抑制促癌基因KRAS的作用抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，從而發(fā)揮抑癌基因的作用[12]。Kandhavelu等[7]通過對結(jié)腸癌患者的血清與腫瘤組織進(jìn)行miRNA高通量篩查發(fā)現(xiàn)miR-96-5p在腫瘤患者中高表達(dá)，這提示miR-96-5p可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

為了明確miR-96-5p在結(jié)腸癌中的作用，我們通過miRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中的miR-96-5p的基因表達(dá)，并通過免疫熒光與RT-PCR實(shí)驗驗證轉(zhuǎn)染效率后，利用MTT、劃痕實(shí)驗、Transwell及凋亡實(shí)驗檢測miR-96-5p對腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡能力的影響，結(jié)果提示抑制腫瘤內(nèi)miR-96-5p基因的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲能力顯著下降，但卻明顯促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步在BALB/c小鼠行皮下成瘤實(shí)驗提示，過表達(dá)miR-96-5p基因可顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的成瘤能力，而抑制miR-96-5p基因的表達(dá)可明顯削弱其的成瘤能力。以上實(shí)驗提示miR-96-5p在結(jié)腸癌中起著促癌基因的作用，下調(diào)miR-96-5p的表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。為進(jìn)一步明確miR-96-5p通過調(diào)控何種蛋白來發(fā)揮促癌作用，我們又通過miRNA靶基因預(yù)測軟件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MTSS1在3'-UTR區(qū)域存在miR-96-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，繼而利用雙熒光素酶報告基因及Western blot實(shí)驗進(jìn)行驗證，結(jié)果提示miR-96-5p可以結(jié)合MTSS1的3'非編碼區(qū)域來抑制后者的轉(zhuǎn)錄從而下調(diào)其蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)移抑制蛋白1(Metastasis suppressor 1,MTSS1)也被稱為轉(zhuǎn)移消失蛋白(Missing in Metastasis),其基因位于染色體8q24.1，在2002年由Lee等在膀胱癌中首次發(fā)現(xiàn)被報道[13]。有研究證實(shí)MTSS1主要定位于細(xì)胞間連接，其分子的中間區(qū)域有著類似于腳手架蛋白的結(jié)構(gòu)，可以通過與細(xì)胞信號通路中的受體蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞間調(diào)控因子的結(jié)合，參與肌動蛋白所介導(dǎo)的細(xì)胞核的形成及細(xì)胞內(nèi)微絲分支穩(wěn)定性的維護(hù)[14]。Wang等[15]在胃癌中發(fā)現(xiàn)MTSSI可以通過抑制PI3K/AKT信號通路來調(diào)控PTEN的表達(dá)，從而降低腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。Taylor MD團(tuán)隊[16]發(fā)現(xiàn)MTSS1的表達(dá)可以抑制肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并可以延長患者生存時間。在結(jié)直腸癌中，蛋白激酶Akt2的缺失使MTSS1的基因與蛋白水平上調(diào)，抑制腫瘤的細(xì)胞增殖、粘附、遷移等生物學(xué)活動[15]。本研究結(jié)果提示在結(jié)腸癌中MTSS1與miR-96-5p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，而下調(diào)miR-96-5p的表達(dá)，使其對MTSS1的靶向調(diào)控作用減弱，后者的表達(dá)增加，最終抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、浸潤能力，并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。

綜上所述，miR-96-5p能夠靶向調(diào)控MTSS1的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，并抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。這為miR-96-5p有望成為結(jié)腸癌早期診斷與治療生物靶基點(diǎn)奠定了實(shí)驗室基礎(chǔ)。