馮 欽 洪晨善 魏曉龍 曾蕓珠 許少偉 彭漢偉

口腔癌在我國(guó)發(fā)病率并不高，但預(yù)后較差。口腔癌以鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)最常見，約占90%[1]。目前OSCC的治療以手術(shù)±放/化療為主，總的5年生存率約50%～70%[2]。PTEN作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有雙磷酸酶活性的抑癌基因在細(xì)胞周期G1期的負(fù)性調(diào)節(jié)中起著重要的作用[3]；而Cyclin D1則是細(xì)胞周期G1/S期中重要的正性調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[4]，兩者共同參與細(xì)胞的有絲分裂并影響細(xì)胞功能。有研究發(fā)現(xiàn)PTEN和Cyclin D1在腫瘤組織中表達(dá)水平的高低與OSCC患者的臨床病理特征之間有密切的關(guān)系[5-6]，而PTEN和Cyclin D1在OSCC組織中的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少。本研究通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)手術(shù)存檔的原發(fā)灶石蠟標(biāo)本中PTEN和Cyclin D1蛋白表達(dá)，探索上述基因的表達(dá)及其與的預(yù)后關(guān)系，為評(píng)估OSCC的預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)

2014年12月至2016年12月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院頭頸科共收治OSCC 216例，選擇其中符合下列標(biāo)準(zhǔn)者78例作為研究對(duì)象：①病理確診口腔鱗癌；②在我院接受根治性手術(shù)±放療治療者；③術(shù)前未進(jìn)行放化療或生物治療；④術(shù)前評(píng)估無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；⑤病例資料完整。

1.2 臨床資料收集

78例口腔鱗癌患者中，男性48例，女性30例；中位年齡60歲(34～83歲)；原發(fā)部位包括口頰8例，舌44例，口底11例，牙齦13例，硬腭2例。吸煙標(biāo)準(zhǔn)：吸煙指數(shù)≥200，飲酒標(biāo)準(zhǔn)：平均每次飲白酒量300克以上，每周1次以上，連續(xù)10年以上。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(UICC/AJCC)分期標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)第7版進(jìn)行分期，其中T117例、T231例、T321例，T49例；N059例，N17例、N211例、N31例；Ⅰ期13例，Ⅱ期26例，Ⅲ期21例，Ⅳ期18例；高分化64例，中分化12例，低分化2例。單純手術(shù)治療67例，術(shù)后輔助放/化療11例。

1.3 免疫組化

實(shí)驗(yàn)試劑：PTEN及Cyclin D1單克隆抗體和廣譜超敏SP試劑盒購(gòu)自福建邁新公司。方法：按照操作說(shuō)明書和免疫組化常規(guī)方法完成。PBS液代替一抗做陰性對(duì)照。用已知PTEN及Cyclin D1蛋白陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判讀

免疫組化計(jì)數(shù)由2位副高以上病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行。Cyclin D1以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，反之陰性，PTEN以胞核和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，反之陰性。著色強(qiáng)度分為4級(jí)：0為未著色，1為淺棕色，2為棕色，3為深棕色。著色密度分為5級(jí)：0為未著色，1為著色細(xì)胞率<20%，2為著色細(xì)胞率21%～40%，3為著色細(xì)胞率41%～60%，4為著色細(xì)胞率>60%。著色強(qiáng)度與密度級(jí)數(shù)和：0為(-)，不表達(dá)；1～3為(+)，低表達(dá)；4～5為(++)，中表達(dá)；6～7為(+++)，高表達(dá)。

1.5 隨訪

全組78例，獲隨訪76例，失訪2例，隨訪率97%；隨訪截止日期為2019年3月31日?？偵?OS)時(shí)間定義為疾病確診至任何原因引起的死亡間隔時(shí)間。無(wú)病生存(DFS)時(shí)間定義為從疾病確診至腫瘤復(fù)發(fā)或腫瘤所致的死亡的間隔時(shí)間，非腫瘤原因所致死亡記錄為刪失數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23軟件進(jìn)行分析。PTEN和Cyclin D1間表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性采用Spearman檢驗(yàn)，采用Kaplain-Meier法做復(fù)發(fā)及生存曲線，并用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行預(yù)后多因素分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN和Cyclin D1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)情況

PTEN和Cyclin D1在OSCC中表達(dá)率為100%，其中PTEN高表達(dá)22例(28.2%)，中表達(dá)47例(60.3%)，低表達(dá)9例(11.5%)；Cyclin D1高表達(dá)39例(50%)，中表達(dá)29例(37.2%)，低表達(dá)10例(12.8%)。

2.2 PTEN表達(dá)與Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性及其臨床病理特征的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：PTEN表達(dá)與cyclin D1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(γ=0.114，P=0.320)(表1)；PTEN表達(dá)與Cyclin D1表達(dá)均與OSCC患者的年齡、組織分化、吸煙、飲酒、復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤是否浸潤(rùn)包膜、血管及神經(jīng)、T分期、術(shù)后病理分期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)，P均>0.05。

表1 口腔鱗癌患者PTEN和Cyclin D1表達(dá)相關(guān)性分析/例

2.3 PTEN表達(dá)和Cyclin D1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

全組失訪2例，隨訪率97.4%，中位隨訪時(shí)間33個(gè)月(5～51個(gè)月)。全組的78例中復(fù)發(fā)29例，其中原發(fā)灶復(fù)發(fā)15例，頸部復(fù)發(fā)8例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移4例，原發(fā)灶及頸部同時(shí)復(fù)發(fā)2例；死亡26例，其中23例死于腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，1例死于放療后第二原發(fā)頸段食管癌，2例死因不明；存活52例，1例帶瘤生存，1例放療后第二原發(fā)癌治療中。

全組3y-OS為65.4%，3y-DFS為53.8%。PTEN高、中、低表達(dá)組患者的3y-OS分別為75.0%、61.4%、55.6%(P=0.095)，3y-DFS分別為51.1%、52.9%、55.6%(P=0.367)，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。Cyclin D1高、中、低表達(dá)組患者的3y-OS分別為65.3%、69.0%、60.0%(P=0.918)，3y-DFS分別為55.1%、54.5%、50.0%(P=0.993)，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.4 影響患者預(yù)后的單因素和多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，吸煙(OS：P=0.020，DFS:P=0.040)、飲酒(OS：P=0.018,DFS:P=0.087)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OS：P=0.050；DFS:P=0.018)和術(shù)后病理分期(OS：P=0.007；DFS:P=0.057)是影響患者OS和DFS的相關(guān)因素(表2)。

將影響生存的可能因素包括年齡、吸煙、飲酒、術(shù)后病理分期、組織分化、PTEN表達(dá)和Cyclin D1表達(dá)等，采用Enter法引入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型中進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示PTEN低表達(dá)(P=0.046)和Cyclin D1高表達(dá)(P=0.011)是影響患者無(wú)病生存的不良預(yù)后因素，PTEN低表達(dá)(P=0.049)也是影響患者總生存的不良預(yù)后因素(表3)。

圖1 PTEN表達(dá)對(duì)口腔鱗癌術(shù)后患者無(wú)病生存(A)和總生存(B)的影響

圖2 Cyclin D1表達(dá)對(duì)口腔鱗癌術(shù)后患者無(wú)病生存(A)和總生存(B)的影響

3 討論

389例口腔鱗癌的回顧性分析研究發(fā)現(xiàn)N分期、臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)外侵犯(ENE)與預(yù)后相關(guān)[7]。盡管上述因素在一定程度上對(duì)口腔鱗癌患者術(shù)后的預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)作用，但是目前仍然缺乏能夠預(yù)測(cè)生存和復(fù)發(fā)概率的精準(zhǔn)手段。為了更加精準(zhǔn)地進(jìn)行個(gè)體化治療，則需要尋找更理想的腫瘤標(biāo)志物以協(xié)助治療方案決策和療效預(yù)測(cè)。

復(fù)習(xí)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶及蛋白磷酸酶的雙重活性，可以使第二信使PIP3(三磷酸磷脂酰肌醇)去磷酸化，進(jìn)一步阻斷對(duì)應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，而后者在細(xì)胞周期G1/S期中具有重要的正性調(diào)控作用，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[5,8-9]。本研究著重探索腫瘤發(fā)生發(fā)展中兩個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)控基因PTEN及Cyclin D1在OSCC病理組織中的表達(dá)，以及兩者之間的相關(guān)性和預(yù)后的價(jià)值。

有學(xué)者[5-6,10]發(fā)現(xiàn)PTEN和Cyclin D1在口腔癌組織中的表達(dá)存在異于正常組織，且與腫瘤病理分級(jí)及病理分期之間存在關(guān)聯(lián)，并指出PTEN能夠下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)。張媛媛等[11]發(fā)現(xiàn)Cyclin D1過(guò)表達(dá)與組織低分化和促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。相反，有研究[12]結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)頭頸鱗癌組織中有Cyclin D1的過(guò)表達(dá)。王心蕊等[13]認(rèn)為PTEN 基因突變?cè)陬^頸部癌癥的過(guò)程中可能不起主導(dǎo)作用。但是，關(guān)于上述兩者在OSCC患者中的表達(dá)及其預(yù)后的關(guān)系相關(guān)研究報(bào)道較少。

表2 影響口腔鱗癌患者生存的單因素分析/%

本研究以未經(jīng)誘導(dǎo)化療、放療或生物治療，直接接受手術(shù)±放/化療的OSCC78例為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)原發(fā)灶組織中PTEN蛋白和Cyclin d1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有病例中PTEN及Cyclin D1均有不同水平的表達(dá)，PTEN表達(dá)水平和Cyclin D1表達(dá)水平之間，以及它們和臨床病理參數(shù)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)，這與部分國(guó)外[10]和國(guó)內(nèi)[5-6,14]的報(bào)道不一致。在本研究實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書和免疫組化常規(guī)方法完成蛋白的檢測(cè)和雙盲讀片，并且設(shè)有陽(yáng)性和陰性對(duì)照，石蠟標(biāo)本保存時(shí)間不長(zhǎng)，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致；但是樣本量相對(duì)較少而且解剖亞區(qū)分布較廣可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚。當(dāng)然，上述其他學(xué)者的研究多為回顧性且入組病例數(shù)量也并不多。因而，我們認(rèn)為PTEN表達(dá)和Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性尚有待加大樣本量?jī)?yōu)化研究設(shè)計(jì)進(jìn)一步探索。

在預(yù)后價(jià)值上，Pickhard等[12]回顧性分析180例頭頸鱗癌病例，結(jié)果顯示的PTEN 的表達(dá)與預(yù)后無(wú)關(guān)。另一項(xiàng)來(lái)自Lee等[15]學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn)PTEN在舌癌中的表達(dá)降低，但是未發(fā)現(xiàn)PTEN 低表達(dá)的患者其OS和DFS有明顯下降。相反，Snietura等[16]認(rèn)為PTEN也許能作為一種有價(jià)值的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后放療的預(yù)后指標(biāo)。Baghaei等[17]一項(xiàng)49例口腔鱗癌病例的回顧性分析表明PTEN的低表達(dá)很可能在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起重要影響。同樣，關(guān)于Cyclin D1的表達(dá)對(duì)預(yù)后影響的研究結(jié)果也不一致，Pickhard A等的研究結(jié)果顯示Cyclin D1過(guò)表達(dá)的患者預(yù)后較差，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065)。其他研究[18]結(jié)果也發(fā)現(xiàn)沒(méi)有證據(jù)支持Cyclin D1蛋白可作為預(yù)后因子。然而Gioacchini等[19]分析研究證明Cyclin D1的過(guò)表達(dá)與高T分期、N分期和臨床分期等不良預(yù)后因素均有關(guān)，是口腔鱗癌患者預(yù)后的潛在重要指標(biāo)。

表3 影響口腔鱗癌患者生存的多因素分析

我們的研究發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)我蛩胤治鲋蠵TEN的高表達(dá)OSCC患者的OS優(yōu)于低表達(dá)組和中表達(dá)組，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.095)，PTEN 的表達(dá)水平不影響患者的DFS(P=0.367)；Cyclin D1的表達(dá)水平與OSCC患者的預(yù)后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(OS：P=0.918；DFS:P=0.993)。然而，當(dāng)我們將年齡、吸煙、飲酒、術(shù)后病理分期、組織分化、PTEN表達(dá)和Cyclin D1表達(dá)等相關(guān)臨床病理因素進(jìn)行多因素Cox模型分析時(shí)發(fā)現(xiàn)PTEN低表達(dá)是影響OSCC患者OS和DFS的獨(dú)立不良預(yù)后因素，Cyclin D1高表達(dá)則是影響患者DFS的獨(dú)立不良預(yù)后因素。

鑒于PTEN和Cyclin D1在Kaplain-Meier生存分析中、兩者之間和與OSCC患者的臨床病理參數(shù)之間均缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)，我們推測(cè)主要是因?yàn)椴±龜?shù)不足及隨訪時(shí)間過(guò)短所致。本組病例Ⅰ期～Ⅱ期3年OS為81.4%，Ⅲ期～Ⅳ期3年OS為51.4%(P=0.007)，N0組與N+組的3年OS分別為71.9%和47.4%(P=0.050)，各組預(yù)后趨勢(shì)顯著，進(jìn)一步說(shuō)明上述分析是合理的。

綜上所述，本隊(duì)列研究結(jié)果提示，在行手術(shù)±放療治療的OSCC中，PTEN表達(dá)和Cyclin D1表達(dá)可能缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，PTEN低表達(dá)和Cyclin D1高表達(dá)是影響OSCC生存的獨(dú)立不良預(yù)后因素，對(duì)OSCC患者的預(yù)后判斷有一定的價(jià)值。確切的結(jié)論尚有待加大樣本量?jī)?yōu)化研究設(shè)計(jì)進(jìn)一步探索。