何世華 尚曉寧 苗良生

結(jié)直腸癌(CRC)是全球范圍內(nèi)最常見的具有高轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤之一。七氟醚是1種揮發(fā)性麻醉劑，據(jù)報(bào)道其在非小細(xì)胞肺癌和腎癌的轉(zhuǎn)移中具有重要的調(diào)控作用[1]。microRNAs(miRNAs)是一類具有21～25個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA，它們對(duì)CRC的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程具有重要的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與多種癌癥中七氟醚介導(dǎo)的生物學(xué)過程。如miR-637通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B途徑介導(dǎo)七氟醚對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用[2]。miR-203作為一種腫瘤抑制因子，可調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的增殖、遷移和侵襲[3]，而且miR-203也介導(dǎo)七氟醚對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控[4]。本文旨在研究七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并探討miR-203在其中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方式

人CRC細(xì)胞系SW620購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，與37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔2～3天換一次培養(yǎng)基。取第3～5代生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

將細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞(1 ml/孔，5×105/ml)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組和七氟醚組，n=4。將培養(yǎng)板置于密閉容器中，于37 ℃恒溫水浴鍋中，密閉容器進(jìn)氣口連接麻醉機(jī)，通入氣體。采用氣體檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)通入七氟醚的濃度。七氟醚組通入4%的七氟醚、5% CO2～95% O2，對(duì)照組通入5% CO2～95% O2，氣體流量均為1 μl/min，持續(xù)通入6 h。然后細(xì)胞在進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.2 劃痕實(shí)驗(yàn)

將2組處理后的細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以1×106個(gè)/皿的濃度將細(xì)胞接種于60 mm的小皿中，培養(yǎng)過夜。用無菌的200 μl的槍頭在垂直于細(xì)胞生長(zhǎng)方向劃痕，用預(yù)冷的PBS洗3次，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)48 h后，在倒置顯微鏡下拍照。計(jì)算遷移速率(m/h)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/48 h。

1.3 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將用無血清培養(yǎng)基配制的Matrigel膠預(yù)先平鋪于Transwell上、下小室之間。將2組處理好的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。取2×105/ml個(gè)細(xì)胞200 μl加入Transwell上小室中，下小室中充滿含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min，200光鏡下計(jì)數(shù)，隨機(jī)選取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.4 Western Blot

采用RIPA裂解液從各組細(xì)胞中提取總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行總蛋白定量分析。將20 g的總蛋白加入上樣緩沖液，用10%的SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%的胎牛血清封閉45 min，于4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗3次，室溫?fù)u床孵育二抗1 h，TBST洗3次，用電化學(xué)發(fā)光試劑ECL暗室發(fā)光。采用凝膠成像系統(tǒng)和Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析條帶。β-actin為內(nèi)參，p-ERK、ERK、β-actin抗體及二抗均購(gòu)自上海碧云天公司，MMP-9、Robo1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用TriZol試劑從各組細(xì)胞中提取總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，用SYBR green熒光染料進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)2-Ct公式計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，miR-203的內(nèi)參用U6，Robo1的內(nèi)參用β-actin。引物由Primer designing tool軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞遷移能力的影響

如圖1所示，七氟醚組的細(xì)胞遷移速率(7.995±0.165)m/h顯著低于對(duì)照組的細(xì)胞遷移速率(4.07±0.17)m/h。

圖1 2組細(xì)胞遷移能力對(duì)比

2.2 七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞侵襲的影響

如圖2所示，七氟醚組穿透Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)[(95.496±5.502)個(gè)]，顯著低于對(duì)照組[(48.391±3.605)個(gè)]。

2.3 七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞ERK/MMP-9通路的影響

如表1所示，與對(duì)照組相比，七氟醚組p-ERK和MMP-9的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而七氟醚組ERK的表達(dá)無顯著變化。

2.4 七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞miR-203及其靶基因的影響

如圖3所示，根據(jù)TargetScan在線軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，miR-203可與Robo1 3’UTR端結(jié)合，且在Robo1 3’UTR端有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)550～557和1441～1448。如表2所示，qRT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，七氟醚組miR-203的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而Robo1 mRNA和Robo1蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖2 2組細(xì)胞侵襲能力對(duì)比

表1 2組ERK/MMP-9通路分子表達(dá)對(duì)比

表2 2組miR-203及其靶基因表達(dá)的對(duì)比

3 討論

在體外研究中，七氟醚可影響非小細(xì)胞肺癌、腎癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[1,5]，因此本研究試圖探討七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞遷移和侵襲的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明4%七氟醚可顯著抑制CRC細(xì)胞的遷移和侵襲。這與Xu等的研究一致，七氟醚可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)其凋亡[6]。ERK信號(hào)參與七氟醚調(diào)控的多種生物學(xué)過程[7]，因此我們推測(cè)七氟醚可能通過ERK途徑抑制CRC細(xì)胞的遷移和侵襲，為了驗(yàn)證此推測(cè)，我們檢測(cè)2組中p-ERK和ERK蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)七氟醚可顯著抑制p-ERK蛋白的表達(dá)，而對(duì)ERK蛋白的表達(dá)無顯著影響，這些結(jié)果提示七氟醚可抑制ERK通路的活性，進(jìn)一步證明七氟醚可通過阻斷ERK途徑抑制CRC的遷移和侵襲。

miR-203在多種癌癥中即可作為致癌因子，也可作為抑癌因子。例如miR-203作為致癌因子促進(jìn)卵巢癌的生長(zhǎng)及遷移[8]。但是目前越來越多的研究報(bào)道m(xù)iR-203作為抑癌因子參與CRC的發(fā)展過程，例如miR-203可通過調(diào)節(jié)真核起始因子5A2抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9]，此外miR-203也可通過調(diào)節(jié)鋅指蛋白217抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[10]。這樣相反的作用效果可能是由于腫瘤環(huán)境的不同造成的。之前的研究也建議miRNAs的失調(diào)與七氟醚的調(diào)節(jié)有關(guān)[2,4]，本研究也發(fā)現(xiàn)七氟醚可顯著上調(diào)CRC細(xì)胞中miR-203的表達(dá)，這也符合之前的報(bào)道，七氟醚通過上調(diào)miR-203的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[6]。此外，在胃癌中miR-203和ERK通路之間也有潛在的調(diào)節(jié)作用[11]。因此我們推測(cè)ERK通路的激活與七氟醚上調(diào)miR-203進(jìn)而抑制CRC的遷移和侵襲有密切的關(guān)系。當(dāng)然詳細(xì)的信號(hào)通路研究還有進(jìn)一步開展，如miR-203阻斷或者ERK通路阻斷是否對(duì)七氟醚調(diào)控的CRC細(xì)胞遷移和侵襲有影響作用。

據(jù)報(bào)道MMPs在癌細(xì)胞的遷移、生長(zhǎng)、炎癥等過程中具有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。MMP-9參與肌醇六磷酸刺激的CRC細(xì)胞的遷移和侵襲過程有關(guān)[12]，而且ERK通路有助于MMP-9誘導(dǎo)多種癌癥轉(zhuǎn)移[13]。因此我們推測(cè)MMP-9可能也參與七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞的調(diào)節(jié)過程，通過對(duì)本研究2組細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，七氟醚可顯著抑制MMP-9的表達(dá)。結(jié)合之前的文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)七氟醚通過阻斷ERK通路，進(jìn)而抑制MMP-9的表達(dá)，最終抑制CRC細(xì)胞的遷移及侵襲。MMP-9是1種蛋白水解酶，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[14]。因此七氟醚抑制CRC細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制可能與阻斷ERK通路，進(jìn)而抑制MMP-9介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)。

功能性miRNAs可通過與特定mRNA的3′-UTR端結(jié)合并調(diào)節(jié)此mRNA的表達(dá)。在骨肉瘤中Robo1與ERK通路有密切的關(guān)系[15]，而且據(jù)報(bào)道m(xù)iR-203可在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可靶向Robo1和ERK/MMP-9通路[16]。因此我們推斷Robo1可能是miR-203的下游靶點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞遷移和侵襲的影響。通過TargetScan在線軟件軟件分析顯示，miR-203可與Robo1 3’UTR端的2個(gè)位點(diǎn)550～557和1441～1448結(jié)合。而且七氟醚可顯著抑制Robo1 mRNA和Robo1蛋白的表達(dá)。這些研究及結(jié)果提示，miR-203可通過靶向Robo1的3’UTR端，抑制Robo1的表達(dá)，進(jìn)而參與七氟醚對(duì)CRC細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控。且miR-203/Robo1對(duì)ERK/MMP-9通路的調(diào)控可能是此過程的分子機(jī)制。本研究還有一些不足之處，例如對(duì)分子機(jī)制的探討還不夠徹底、缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究，另外目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是多種癌癥(包括CRC)治療失敗、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的源頭，七氟醚是否對(duì)腫瘤干細(xì)胞也有同樣的調(diào)節(jié)作用是我們將來要研究的內(nèi)容之一。

圖3 miR-203及其靶基因Robo1結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)圖

總之，本研究表明七氟醚可抑制CRC細(xì)胞的遷移和侵襲，機(jī)制可能與其調(diào)控miR-203/Robo1的表達(dá)，進(jìn)一步阻斷ERK/MMP-9通路有關(guān)。