朱 清 李世東 朱旭利

喉癌(laryngeal cance)以鱗狀細胞癌最為常見，臨床表現(xiàn)為聲嘶、呼吸困難、咳嗽、吞咽困難、頸部淋巴結轉移等，早期發(fā)現(xiàn)、盡早診斷和治療對減輕喉癌的危險十分重要，一方面可明顯提高患者術后的生存率，其次可最大程度保留喉的發(fā)音功能，減少術后并發(fā)癥[1]。程度死亡因子1屬于CD28的家族成員，其配體有PD-L1和PD-L2，其中前者與PD-1結合后能夠傳遞負性調(diào)控信號，抑制T細胞活化和增殖，并且促進T細胞凋亡，在機體免疫中發(fā)揮著至關重要的作用[2]。本研究旨在通過免疫組化法分析PD-1蛋白和PD-L1蛋白在喉癌發(fā)生、發(fā)展過程中的表達情況，并且分析其與患者病理特征之間的關系，以期探討喉癌發(fā)生的可能機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

將我院自2018年6月至2019年6月間收治的經(jīng)手術和組織病理學確診為喉癌的64例患者作為研究組，選擇同期入院體檢存在聲帶息肉的患者61例作為對照組。研究組男性35例，女性29例，年齡36～78歲，平均年齡(48.81±5.29)歲；對照組男性34例，女性27例，年齡34～76歲，平均年齡(48.23±5.36)歲。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入和排除標準

納入標準：所有患者經(jīng)手術或組織病理學確診為喉癌，在術前未接受過化療或放療。

排除標準：合并有咽喉部位其它炎性疾病、惡性腫瘤和存在手術禁忌證的患者。

1.3 主要儀器和試劑

儀器：組織包埋機、組織切片機、攤片機、烘片機、不銹鋼壓力鍋、電磁爐、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冷藏冰箱、光學顯微鏡、載玻片、蓋玻片等。

試劑：PD-1兔抗人單克隆抗體ab137132，PD-L1兔抗人單克隆抗體ab205921，即用型免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)，EDTA抗原修復液pH9.0，石蠟，4%多聚甲醛、乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木精等。

1.4 方法

所有采集的標本經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋后切成4 μm厚度組織切片，再經(jīng)脫蠟劑脫蠟，梯度濃度乙醇脫水，蒸餾水清洗，PBS浸泡，用EDTA高溫高壓抗原修復110 s，再用3%雙氧水、封閉用山羊血清處理，加一滴1∶100兔抗人PD-1和PD-L1，置于4 ℃孵育過夜，再依次加入二抗、辣根過氧化物酶標記酶卵白素工作液，給予DAB顯色，鹽酸乙醇分化、反藍和脫水處理，最后用中性樹膠封片，每例實驗重復進行2次[3]。

PD-1和PD-L1在組織中陽性顯色評定標準為在細胞膜或細胞質(zhì)中表現(xiàn)出淡黃色或棕褐色的顆粒，在腫瘤細胞或間質(zhì)細胞內(nèi)出現(xiàn)陽性顯色；染色強度評分如下：細胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色顆粒為弱染色，記1分；出現(xiàn)棕黃色顆粒為中等染色，記2分；出現(xiàn)棕褐色顆粒為強染色，記3分。隨機選取5個400×的視野，每個視野100個腫瘤細胞或間質(zhì)細胞中PD-1或PD-L1陽性顯色強度≥2分的細胞數(shù)目≥5%時或陽性顯色強度與陽性細胞數(shù)目相乘的結果≥10%時判定為該切片陽性表達[4]。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 HE染色結果

光鏡下觀察可見研究組患者癌細胞具有明顯的結構異型性和細胞異型性，部分高分化鱗癌可見角化珠，對照組患者可見黏膜組織水腫，鱗狀細胞仍整齊排列，無明顯的結構和細胞異型性。

2.2 2組對象樣本PD-1和PD-L1的表達情況

研究組PD-1表達陽性率為62.50%，明顯高于對照組8.20%；PD-L1陽性表達率為68.75%，明顯高于對照組13.11%，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組對象樣本PD-1和PD-L1的表達情況(例，%)

2.3 研究組樣本PD-1和PD-L1表達情況的相關性分析

64例研究組患者中40例PD-1陽性表達的喉癌組織有37例為PD-L1陽性表達，經(jīng)χ2檢驗可知喉癌組織中PD-1和PD-L1表達呈明顯的正相關性(P<0.05)，見表2。

表2 研究組樣本PD-1和PD-L1表達情況的相關性分析

2.4 喉癌組織PD-1和PD-L1表達和臨床病理特征的關系

PD-1、PD-L1表達和喉癌臨床分期和腫瘤分化程度密切相關，與患者癌組織發(fā)生部位無關，見表3。

表3 喉癌組織PD-1和PD-L1表達和臨床病理特征的關系(例，%)

3 討論

PD-1又名CD279，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，能夠抑制機體免疫系統(tǒng)的功能，其實質(zhì)為位于淋巴細胞表面的受體蛋白，主要位于T淋巴細胞表面，具有負向調(diào)節(jié)T淋巴細胞活性的功能，抑制T淋巴細胞增殖、分化，減少相關細胞因子的合成和分泌。PD-1有2種結合配體，分別為PD-L1和PD-L2，又名CD274，屬于B7家族的成員之一，在活化的T、B細胞和其它免疫細胞表面廣泛的表達；PD-L2為CD273，主要表達于活化的樹突狀細胞、巨噬細胞表面，因此PD-L1在體內(nèi)發(fā)揮的作用要遠遠超過PL-L2[5]。機體內(nèi)的免疫反應是一個復雜的現(xiàn)象，主要是由催化劑和抑制劑之間通路的調(diào)節(jié)活動達到平衡，其中PD-1和PD-L1是其中的一種抑制劑，能夠抑制腫瘤特異性的T細胞發(fā)揮免疫效應，介導免疫逃逸機制[6]。

正常機體組織很少在細胞表面表達PD-L1蛋白，說明其轉錄是在機體生理免疫系統(tǒng)的嚴密監(jiān)控下進行的，已經(jīng)有研究證實，γ-IFN、TNF、IL-4、IL-10等多種細胞因子能夠上調(diào)PD-L1在不同細胞中的表達，而且PD-1和PD-L1在多種惡性腫瘤患者中的表達率明顯升高，而且其表達情況與部分惡性腫瘤的TNM分期和預后密切相關[7]。本次研究結果顯示，喉癌患者PD-1表達陽性率為62.50%，PD-L1陽性表達率為68.75%，和對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而且兩者之間的表達呈明顯的正相關性，PD-1和PD-L1在喉癌組織的表達程度與患者癌癥臨床分期和癌組織分化程度密切相關，臨床分期越高、組織分化程度越高，陽性表達率越高，這一結果與文獻報道基本一致[8-9]。由此可以證實，PD-1和PD-L1在喉癌的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用，其中PD-L1可能減弱T細胞的功能和細胞凋亡，與機體內(nèi)其他蛋白相互作用達到負性調(diào)節(jié)的作用，其信號通路可能與激活絲裂原活化蛋白激酶-分裂原活化抑制劑(MAPK-MEK)途徑、表皮生長因子受體途徑(EGFR)、信號轉導及轉錄活化因子途徑、C-JUN途徑、鈣離子信號途徑和核轉錄因子途徑有關[10]。

綜上所述，PD-1和PD-L1在喉癌患者癌組織中具有較高的陽性表達率，兩者表達呈明顯的正相關，患者表達情況與其臨床TNM分期和癌組織分化程度密切相關，可將其作為喉癌發(fā)生發(fā)展的指標。