王曉燕 岳丹偉 孫培利 焦 捷 院珍珍,2,3曹效海,3 王樹林,2,3

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院1，西寧 810016) (青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，西寧 810016) (青海-甘肅食品研發(fā)與檢測(cè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室3，西寧 810016)

高糖食品和精制谷物以及較低膳食纖維的攝入，易導(dǎo)致慢性疾病的發(fā)生[1,2]，糖含量低或食用后不會(huì)明顯增加餐后血糖水平的低糖食品可以預(yù)防口腔病、保護(hù)眼睛、降低肥胖，同時(shí)能為糖尿病人帶來(lái)便利[3]。青稞是青藏高原一種重要的谷物，具有三高兩低的特點(diǎn)，即高蛋白、高纖維、高維生素和低脂、低糖[4]，兼具抗癌、降血脂及降血糖等功效[5]，決定了青稞制品是糖尿病患者首選的優(yōu)質(zhì)谷物類食物。但由于青稞中的淀粉含量與普通谷物相近，且消化率較高，進(jìn)食青稞產(chǎn)品也會(huì)同其他谷物一樣迅速引起血糖的升高[6]，限制了其在糖尿病人專用食品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

降低糖含量的方法主要有酶法、化學(xué)法、微生物法[7-9]。而增加淀粉抗消化性的方法主要有物理法、酶法和微生物法[10-12]。酶法制備低糖食品具有降低糖含量及降低食物消化率的雙重效果，且具有高效和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[11]。沙云菲等[13]用淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶配制的復(fù)合酶制劑降解上部煙葉中的淀粉，最終可達(dá)到19.54%的淀粉降解率，黃群等[14]用淀粉酶和糖化酶協(xié)同酶解葛根淀粉的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)酶解工藝能夠有效降低葛根淀粉含量，李湘江等[15]研究也表明淀粉酶能夠有效降解麥麩淀粉，因此酶法是降低食品糖含量的有效方法。

目前青稞低糖化及其降糖工藝的研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選不同的淀粉酶對(duì)青稞進(jìn)行酶解得到優(yōu)勢(shì)降糖酶，并探索酶的調(diào)配比例和水解條件以確定降糖的最佳酶劑和工藝條件，制備低糖青稞粉，以期為糖尿病人以及肥胖病人的專用食品開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青稞：昆侖14號(hào)，產(chǎn)自青海省海北州。

高溫α-淀粉酶(40 000 U/mL)、β-淀粉酶(700 000 U/ mL)、糖化酶(100 000 U/mL)，普魯蘭酶(1 500 U/mL)、3,5二硝基水楊酸(化學(xué)純)、氫氧化鈉(分析純)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TH2-82恒溫振蕩器，UV-2600紫外分光光度計(jì)，HH-6電熱恒溫水浴鍋，DHG 9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 技術(shù)路線

青稞→浸潤(rùn)→壓片處理→加入酶解液→酶解→滅酶→水洗離心→收集固體→烘干→低糖青稞→制粉

1.2.2 關(guān)鍵工藝及實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)

浸潤(rùn)：將青稞加水潤(rùn)濕降低其硬度。

壓片處理：潤(rùn)濕的青稞，放入壓面機(jī)中，利用輥輪將青稞壓扁，反復(fù)通過(guò)輥輪3遍。

酶解液配制：取一定單位的酶液用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中。

酶解：加酶量以每克青稞壓片中加入的酶單位計(jì)，加入酶解液震蕩搖勻，放入恒溫振蕩水浴鍋(35～75 ℃)中以140 r/min的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩酶解。

滅酶：在沸水浴中處理20 min。

水洗離心：酶解結(jié)束后，將發(fā)酵液去除，離心得到的固體用蒸餾水洗滌并再次離心，重復(fù)2～3次。

烘干：將收集得到的固體放于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干。

1.2.3 水解度測(cè)定

淀粉水解度=(樣品酶解液還原糖含量-非酶解液對(duì)照樣品還原糖含量)/總糖含量[16]

還原糖含量的測(cè)定方法：采用DNS法測(cè)定酶解液中還原糖的含量[17-18]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖濃度與吸光度之間的線性關(guān)系，其回歸方程為y=1.078x+0.016 3，R2=0.999 2。

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16,17]測(cè)定總糖含量，青稞中總糖以葡萄糖計(jì)，經(jīng)測(cè)定，青稞中總糖含量為(0.704 2±0.017 3)g/g。

1.3 適宜淀粉酶的篩選

取適量青稞壓片，選用α-淀粉酶、β-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶作為酶解青稞淀粉的淀粉酶，淀粉酶的添加量為15、30、45、60 U/g，65 ℃下酶解3 h，以淀粉水解度為指標(biāo)，篩選酶解青稞淀粉的最適水解酶。

1.4 α-淀粉酶、普魯蘭酶、糖化酶酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)

取適量青稞壓片，料液比1∶10，分別考察α-淀粉酶、普魯蘭酶、糖化酶三種酶加酶量(50、100、150、200、250 U/g)、酶解溫度(35、45、55、65、75 ℃)和酶解時(shí)間(1、2、3、4、5 h)對(duì)酶解效果的影響。

1.5 復(fù)合酶酶配比的篩選

取適量青稞壓片，料液比為1∶10，加酶總量為200 U/g，α-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶的比例分別為1∶1∶1、1∶2∶2、1∶3∶3、2∶1∶2、2∶2∶3、2∶3∶1、3∶1∶3、3∶2∶1、3∶3∶2，在65 ℃條件下酶解3 h，測(cè)定淀粉水解度，選取最佳復(fù)合酶配比。

1.6 復(fù)合酶酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定最佳復(fù)合酶配比，分別考察復(fù)合酶加酶量(50、100、150、200、250 U/g)、酶解溫度(35、45、55、65、75 ℃)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5 h)和料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20)對(duì)酶解效果的影響。

1.7 復(fù)合酶酶解工藝的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、酶添加量、酶解時(shí)間和料液比4個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9(43)正交表，以淀粉水解度為指標(biāo)，優(yōu)化復(fù)合酶酶解工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均用3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶的篩選

如圖1所示，α-淀粉酶、糖化酶及普魯蘭酶對(duì)青稞淀粉具有較好的水解效果，隨著酶添加量的增加，青稞淀粉的水解度不斷增加；β-淀粉酶在酶添加量達(dá)到45 U/g時(shí)淀粉水解度達(dá)到最高，進(jìn)一步增加酶量，淀粉水解度不會(huì)增加。因此，選用α-淀粉酶，普魯蘭酶和糖化酶作為酶解青稞淀粉的適宜淀粉酶。

注：不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05，余同。圖1 不同淀粉酶對(duì)青稞淀粉水解度的影響

2.2 單酶酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 單酶添加量

由圖2可知，隨著淀粉酶添加量的增加，在酶解初始階段水解度隨著酶添加量的增加而增大，α-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶的酶添加量達(dá)到150、150、200 U/g時(shí)，淀粉水解度最高，形成較多的淀粉鏈，水解產(chǎn)物積累至一定濃度反向抑制酶的水解[14]，繼續(xù)增加酶量，酶解反應(yīng)趨于平穩(wěn)，不會(huì)繼續(xù)隨著酶添加量的增加而升高。綜上，確定α-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶的適宜酶添加量為150、150、200 U/g。

圖2 淀粉酶添加量對(duì)青稞淀粉水解度的影響

2.2.2 單酶酶解時(shí)間

由圖3可知，隨著淀粉酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，青稞淀粉水解度不斷增大，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，水解度最大，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解反應(yīng)時(shí)間，支鏈淀粉的減少以及過(guò)多的小分子淀粉的產(chǎn)生抑制淀粉的水解[19-20]，使得淀粉水解度逐漸趨于穩(wěn)定。綜上，確定α-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶的適宜酶解時(shí)間為2、3、3 h。

圖3 淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)青稞淀粉水解度的影響

2.2.3 單酶酶解溫度

由圖4可知三種酶的酶解溫度升高到65 ℃時(shí)，青稞淀粉的水解度最大。溫度對(duì)酶活影響最顯著，而酶活進(jìn)一步會(huì)影響酶解效果[19]。溫度超過(guò)65 ℃，α-淀粉酶仍能保持較好的酶解效果，并沒(méi)有因?yàn)闇囟鹊纳叨耆Щ睿黄蒸斕m酶和糖化酶出現(xiàn)大量失活現(xiàn)象，從而水解度明顯下降[21]。此外，溫度高也會(huì)導(dǎo)致淀粉的降解，非酶解液還原糖的升高亦會(huì)導(dǎo)致淀粉水解度的降低[21]。綜上，α-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶的適宜酶解溫度均為65 ℃。

圖4 淀粉酶酶解溫度對(duì)青稞淀粉水解度的影響

2.3 復(fù)合酶酶配比的篩選

由圖2、圖3、圖4可知單一酶的適宜添加量差量不大，故復(fù)合酶配方比例控制在3倍以內(nèi)，由表2可知，當(dāng)α-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶的比例為1∶2∶2時(shí)，淀粉水解度最高，優(yōu)于任何一種單一酶的水解效果，故選取α-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶的比例為1∶2∶2的酶配方。

表2 復(fù)合酶的配比對(duì)淀粉水解度的影響

2.4 復(fù)合酶酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，淀粉水解度隨著復(fù)合酶初始酶添加量的增加而增大，當(dāng)添加量達(dá)到200 U/g時(shí)，淀粉水解度最高，酶添加量大于200 U/g后，水解產(chǎn)物積累抑制淀粉酶的水解[14,19]，淀粉水解度逐漸趨于穩(wěn)定。當(dāng)溫度升高至65 ℃時(shí)，青稞淀粉的水解度最高，隨著溫度的繼續(xù)升高，水解度明顯下降，溫度過(guò)高時(shí)普魯蘭酶和糖化酶會(huì)失活[22]，但α-淀粉酶在較高溫度下還能繼續(xù)保持活性。隨著復(fù)合酶酶解反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，青稞淀粉的水解度不斷增大，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，水解度最高，隨后復(fù)合酶的酶解反應(yīng)趨于平衡，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解反應(yīng)時(shí)間，水解度沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。青稞淀粉的水解度在料液比為1∶10時(shí)最高，料液比較大時(shí)，酶與淀粉的流動(dòng)性較低，不易酶解；料液比過(guò)小時(shí)，導(dǎo)致溶液中的酶濃度降低，酶與淀粉的接觸機(jī)率變少[23]，在料液比比例較小時(shí)和較大時(shí)，青稞淀粉的水解度都較低。

圖5 復(fù)合酶酶解過(guò)程中單因素對(duì)水解度的影響

2.5 復(fù)合酶酶解工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3、表4可知，四個(gè)因素對(duì)酶解淀粉的影響程度為B>D>C>A，即溫度>酶總量>酶解時(shí)間>料液比。由極差分析可得，青稞淀粉的最佳酶解工藝條件組合為A3B1C3D3，該組合在正交組合中沒(méi)有出現(xiàn)，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)A3B1C3D3組合得到淀粉水解度達(dá)到(62.76±1.73)%，高于表3中淀粉水解率最高的A3B1C3D2組合，因此確定酶法降解青稞淀粉的最佳酶解工藝復(fù)合酶配方為α-淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶為1∶2∶2，復(fù)合酶添加量為250 U/g、酶解時(shí)間3.5 h、酶解溫度為60 ℃，料液比為1∶13。

表3 復(fù)合酶工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)與極差分析結(jié)果表

表4 復(fù)合酶工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表

3 討論

α-淀粉酶、普魯蘭酶及糖化酶對(duì)青稞中的淀粉具有較好的水解能力，相同酶添加量條件下，復(fù)合酶作用底物的淀粉水解度比單一酶α-淀粉酶、普魯蘭酶及糖化酶分別提高了0.72、0.71和0.29倍，黃群等[14]在淀粉酶酶解葛根淀粉實(shí)驗(yàn)中及李湘江等[15]在淀粉酶水解麥麩淀粉工藝優(yōu)化研究中也發(fā)現(xiàn)多種淀粉酶具有協(xié)同作用，復(fù)合酶優(yōu)于單一酶的水解。

在酶解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，淀粉水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)或酶量的增加而增加，淀粉水解度達(dá)到最高值后，淀粉水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)或酶量的增加無(wú)顯著變化或出現(xiàn)略微下降趨勢(shì)。劉程玲[18]用普魯蘭酶作用于紅薯淀粉實(shí)驗(yàn)和其他研究者[16,19-20]用酶作用于淀粉實(shí)驗(yàn)中亦有此類現(xiàn)象，這可能是酶解過(guò)程中淀粉短鏈和還原糖增加，以及底物濃度降低，從而抑制酶解過(guò)程或減緩酶解反應(yīng)速率。此外，料液比是影響酶解反應(yīng)的另一重要因素，料液比過(guò)大時(shí)，酶濃度較高，溶液的黏度較大，使得淀粉酶的酶解作用受到抑制，水解不徹底；料液比過(guò)低時(shí)，酶濃度降低，減少了酶分子與淀粉分子接觸的機(jī)會(huì)[14-15,23]。

實(shí)驗(yàn)最終優(yōu)化工藝結(jié)果表明酶解可降低青稞中60%以上的淀粉，淀粉降解的同時(shí)帶來(lái)非淀粉物質(zhì)的富集，使得同質(zhì)量酶解的青稞壓片與非酶解青稞壓片相比具有更多的非淀粉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此降解后的青稞更符合患有糖尿病及其他慢性疾病人群的飲食需求。

4 結(jié)論

α-淀粉酶、普魯蘭酶及糖化酶對(duì)青稞中的淀粉具有較好的水解能力，復(fù)合酶的酶解效果比單一酶的酶解效果更好，通過(guò)對(duì)復(fù)合酶酶解工藝的優(yōu)化，提高了淀粉酶酶解青稞淀粉的效果，采用優(yōu)化工藝可有效降解青稞中60%以上的淀粉，故使用淀粉酶降低青稞中淀粉含量的技術(shù)和工藝是可行的。