劉佳，萬思敏，白露，李建華

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系, 教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室, 上海 200032

B細(xì)胞免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體對于人類多種急、慢性病毒(如新型冠狀病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒等)感染的病原清除及持續(xù)保護至關(guān)重要[1-3]，應(yīng)答過程涉及眾多基因的差異表達(dá)，但這些基因如何在其中起作用仍不完全清楚[4]。通過構(gòu)建基因敲除小鼠鑒定基因功能的經(jīng)典方法耗時、耗力，無法快速確立相關(guān)功能，而在體外B細(xì)胞系水平的研究又不能完全代表其在體內(nèi)正常免疫反應(yīng)中的功能[5-6]，因此，建立一種體外有效敲低原代B細(xì)胞中目的基因表達(dá)并通過過繼轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi)鑒定基因功能的方法具有重要意義。目前已有較為成熟的基于反轉(zhuǎn)錄病毒感染的T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方法[7-9]，經(jīng)單次感染即可達(dá)到60%～65%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[8]，但缺乏一種高效轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞以敲低目的基因并進(jìn)一步回輸體內(nèi)觀察其增殖和分化情況的方法[10-11]。究其原因，主要存在以下幾個方面的問題：①表達(dá)短發(fā)夾核糖核酸(short hairpin RNA，shRNA)的反轉(zhuǎn)錄病毒滴度較低，導(dǎo)致B細(xì)胞的感染率較低；②缺乏既能增殖B細(xì)胞，又能維持B細(xì)胞自身屬性的體外培養(yǎng)系統(tǒng)；③懸浮的原代B細(xì)胞不易被病毒感染；④經(jīng)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)后的B細(xì)胞，過繼轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)后較難收獲足夠多的增殖和分化的B細(xì)胞以供表型分析。

為此，本研究基于pLMpd-Ametrine載體和plat-E細(xì)胞包裝系統(tǒng)，通過共轉(zhuǎn)染Drosha酶特異性小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，增加反轉(zhuǎn)錄病毒RNA穩(wěn)定性來提高病毒滴度。使用抗CD180抗體(α-CD180)增殖原代B細(xì)胞，在B細(xì)胞處于活躍的增殖活化狀態(tài)下經(jīng)2次離心感染(spin infection)轉(zhuǎn)導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄病毒，使B細(xì)胞可獲得超過30%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。最后，利用上述優(yōu)化方案，成功敲低并驗證了 B細(xì)胞功能基因Bcl6的抗凋亡功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、載體及細(xì)胞水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)由本室保存，其誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答在病毒感染的清除中起重要作用，是一種被廣泛應(yīng)用于抗病毒體液免疫研究的模式病毒。使用Vero細(xì)胞擴增，用BHK21細(xì)胞做空斑形成實驗，測定滴度后于-80 ℃保存[12]。反轉(zhuǎn)錄病毒包裝載體pLMpd-Ametrine(加利福尼亞大學(xué)Jason Cyster教授惠贈)攜帶Ametrine標(biāo)簽，可直接用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測[13-14]。plat-E細(xì)胞(南京醫(yī)科大學(xué)王曉明教授惠贈)基于293T細(xì)胞構(gòu)建，通過EF1α啟動子啟動病毒結(jié)構(gòu)基因gag-pol和env的表達(dá)，可穩(wěn)定、高效產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒[15]。pLMpd-Ametrine載體經(jīng)plat-E細(xì)胞包裝產(chǎn)生攜帶特定基因片段的反轉(zhuǎn)錄病毒。NIH/3T3細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)鄧強教授惠贈。

1.1.2 實驗小鼠VSV特異性B細(xì)胞(VI10 B)取自VI10YEN小鼠(圣拉斐爾科學(xué)研究所Matteo Iannacone教授惠贈)。VI10YEN小鼠攜帶轉(zhuǎn)基因的輕鏈和基因敲入的重鏈，使B細(xì)胞可特異性識別VSV并對其產(chǎn)生應(yīng)答，在抗病毒體液免疫反應(yīng)的研究中得到了廣泛的應(yīng)用[16-18]，飼養(yǎng)在復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心。C57BL/6小鼠(SPF級)購自上海靈暢生物科技有限公司。 小鼠6～12周齡，實驗設(shè)計符合復(fù)旦大學(xué)實驗動物倫理要求。

1.1.3 主要試劑DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基購自Corning公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Biological Industries公司，PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自Takara公司，B細(xì)胞陰性選擇試劑盒購自Biolegend公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和CD180抗體購自Thermo Scientific公司，流式抗體購自Biolegend和eBioscience公司，Bcl6(D412V)XP兔單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司。

B細(xì)胞培養(yǎng)基配方：RPMI 1640、FBS(10%)、非必需氨基酸(1∶100)、雙抗(Pen/Strep，100 IU/100 μg/mL)、β-巰基乙醇(55 μM)、丙酮酸(1 mmol/L)、谷氨酸(2 mmol/L)、羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid，HEPES)緩沖液(10 mmol/L)。

流式細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)緩沖液為含2%FBS的PBS。

1.2 方法

1.2.1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建Bcl6是一種轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，在B細(xì)胞生發(fā)中心反應(yīng)中高表達(dá)，可通過抑制p53腫瘤抑制基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)生發(fā)中心B細(xì)胞中DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)[19]。因此，選擇了已被證明有敲低效率的Bcl6shRNA對系統(tǒng)進(jìn)行驗證[20]，以靶向海腎熒光素酶(RenillaLuciferase，ren.713)的shRNA作為無關(guān)shRNA對照。靶向Ren.713和Bcl6的shRNA寡核苷酸[20-21]序列如下。

Ren.713：

CTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACA-GTGAGCGCAGGAATTATAATGCTTATCTA-TAGTGAAGCCACAGATGTATAGATAAGC-ATTATAATTCCTATGCCTACTGCCTCGGA-ATTC

Bcl6-1：

TGCTGTTGACAGTGAGCGCGGCAAGT-CCCTAATGAGTATATAGTGAAGCCACAGA-TGTATATACTCATTAGGGACTTGCCTTGC-CTACTGCCTCGGA

Bcl6-2：

TGCTGTTGACAGTGAGCGGCTGTCAA-AGAGAAGGCTTTATAGTGAAGCCACAGAT-GTATAAAGCCTTCTCTTTGACAGCTGCCTA-CTGCCTCGGA

以上寡核苷酸經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司合成后，用5′primer：5′-CAGAAGGC-TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGA-GCG-3′，3′primer：5′-CTAAAGTAGCCCCTT-GAATTCCGAGGCAGTAGGCA-3′擴增寡核苷酸[22]，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物膠回收后用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，連入pLMpd-Ametrine質(zhì)粒，通過測序進(jìn)行驗證。經(jīng)3T3/NIH細(xì)胞篩選得到以上2個有效的Bcl6 shRNA，B細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)實驗展示數(shù)據(jù)由Bcl6 shRNA-1完成。

1.2.2 轉(zhuǎn)染plat-E細(xì)胞產(chǎn)生病毒plat-E細(xì)胞鋪板后至匯合度約為80%時，用lipo 2000轉(zhuǎn)染pLMpd-Ametrine質(zhì)粒。因細(xì)胞內(nèi)自身存在降解shRNA的Drosha酶，轉(zhuǎn)錄形成的含有miR-shRNA的病毒會被內(nèi)源性Drosha酶剪切，進(jìn)而導(dǎo)致能夠包裝成病毒的shRNA數(shù)目減少，因此共同轉(zhuǎn)染Drosha的siRNA可提高plat-E細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的穩(wěn)定性[23-24]，從而增加B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。后續(xù)實驗使用摸索得到的最佳濃度siRNA Drosha與pLMpd-Ametrine質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染8 h后，更換培養(yǎng)液。分別在更換培養(yǎng)液后的24 h和48 h收集病毒上清液，添加HEPES(終濃度10 mmol/L)和聚凝胺(polybrene)(終濃度5 μg/mL)。

1.2.3 B細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，在無菌條件下取含CD45.1/2的VI10YEN小鼠脾臟，陰性選擇B細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，加入CD180抗體(1∶4 000)置于37 ℃培養(yǎng)。

1.2.4 B細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)CD180抗體活化的VI10 B 細(xì)胞無剎車離心5 min，去除培養(yǎng)液后加入由plat-E細(xì)胞包裝得到的新鮮反轉(zhuǎn)錄病毒，混勻后室溫?zé)o剎車模式 2 450 rpm(1 100×g)離心90 min。離心結(jié)束后吸去病毒上清液，用含CD180抗體的B細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第1次離心感染后24 h，再次收集反轉(zhuǎn)錄病毒上清液，重復(fù)離心感染一次。

1.2.5 小鼠VSV感染在第1次離心感染當(dāng)天，給將要接受過繼轉(zhuǎn)移VI10 B細(xì)胞的C57BL/6小鼠(CD45.2)尾靜脈注射VSV，每只2×106pfu(plaque forming unit, PFU)。

1.2.6 轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至C57BL/6小鼠將1.2.4中離心感染2次后的VI10 B細(xì)胞用RPMI 1640洗滌、重懸并經(jīng)小鼠眼眶下靜脈注射過繼轉(zhuǎn)移(adoptive transfer)至1.2.5中預(yù)先感染VSV的C57BL/6小鼠。

1.2.7 轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞增殖、分化情況的檢測體外觀察刺激劑對B細(xì)胞的影響，陰性選擇后的B細(xì)胞直接加相應(yīng)刺激劑培養(yǎng)至指定時間后流式細(xì)胞染色即可，涉及的染色抗體：anti-CD80_APC、anti-CD86_BV605 和anti-CD138_PE。對于體內(nèi)增殖的轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞，在過繼轉(zhuǎn)移后相應(yīng)天數(shù)處死小鼠取脾制備單細(xì)胞懸液，按以下配色方式進(jìn)行細(xì)胞表面染色：anti-GL-7_PE、anti-B220_PerCP-Cy5.5、anti-FAS_APC、APC-eFluor 780、anti-CD45.1_Pacific Blue，以上抗體均為1∶200加入(APC-eFluor 780以1∶1 000 加入)，冰上孵育40 min，F(xiàn)ACS 緩沖液洗滌2次后，使用流式細(xì)胞儀Attune NxT Flow Cytometer(Thermo Scientific)進(jìn)行檢測。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法與作圖流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)用FlowJ_V10軟件分析，免疫印跡試驗(Western Blot)數(shù)據(jù)用Image J進(jìn)行灰度分析。以上數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism5軟件統(tǒng)計整理。組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究將攜帶shRNA的片段克隆進(jìn)pLMPd-Ametrine質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染plat-E細(xì)胞，獲得反轉(zhuǎn)錄病毒。用病毒上清液對VSV特異性B細(xì)胞進(jìn)行2次離心感染，最終可獲得30%以上的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。這些B細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至預(yù)先感染VSV的小鼠后可強烈增殖和分化。轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向B細(xì)胞分化過程中重要抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子Bcl6的shRNA導(dǎo)致分化過程中轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞數(shù)量減少。

2.1 CD180抗體能刺激原代B細(xì)胞大量增殖并維持其自身屬性

B細(xì)胞增殖后在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后過繼轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)再分化，是鑒定目的基因功能的理想方法。但是目前很多體外培養(yǎng)系統(tǒng)在刺激B細(xì)胞增殖的同時，也會使B細(xì)胞進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞[10]。CD180為Toll樣蛋白[25]，本研究發(fā)現(xiàn)CD180抗體刺激可使B細(xì)胞相同程度地形成集落增殖灶(結(jié)果未顯示)，且活化標(biāo)志物CD80、CD86的表達(dá)顯著高于未接受刺激的B細(xì)胞(圖1A)；盡管經(jīng)脂多糖(LPS)刺激的B細(xì)胞能被激活并增殖(圖1A)，但是約有30% 的CD138表達(dá)陽性，即分化為漿細(xì)胞，而α-CD180激活的B細(xì)胞則未見明顯分化(圖1B)。因此，本研究通過CD180抗體刺激成功構(gòu)建了原代B細(xì)胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，在這一培養(yǎng)系統(tǒng)中B細(xì)胞可在維持B細(xì)胞自身屬性的情況下強烈增殖。

2.2 干擾 Drosha的表達(dá)能顯著提高反轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生

制備高滴度的反轉(zhuǎn)錄病毒是高效轉(zhuǎn)導(dǎo)的前提[26]。包裝shRNA的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的RNA因攜帶發(fā)卡結(jié)構(gòu)而易被plat-E包裝細(xì)胞中的Drosha酶切割，使得病毒滴度極大降低[24]。為消除細(xì)胞內(nèi)Drosha酶對反轉(zhuǎn)錄病毒RNA穩(wěn)定性的影響，在轉(zhuǎn)染pLMpd-Ametrine的同時，共轉(zhuǎn)染了不同濃度的Drosha酶特異性siRNA，濃度在10～100 pmol均可有效敲低plat-E細(xì)胞中Drosha酶的表達(dá)(圖2A)。進(jìn)一步將由共轉(zhuǎn)染Drosha酶特異性siRNA所獲得的反轉(zhuǎn)錄病毒感染B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染 20 pmol Drosha酶特異性siRNA可使B細(xì)胞獲得較高的感染效率(圖2B、C)。因此，通過在病毒包裝細(xì)胞中干擾Drosha酶的表達(dá)解決了表達(dá)shRNA的反轉(zhuǎn)錄病毒滴度較低的問題。

2.3 2次離心感染可顯著提升B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

與原代T細(xì)胞相比，B細(xì)胞在體外很難被病毒有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。T細(xì)胞在體外單次離心感染即可獲得30%以上的感染效率[8]，而原代B細(xì)胞單次感染效率非常低。本研究嘗試重復(fù)離心感染以提高B細(xì)胞的感染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重復(fù)離心感染使B細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在共轉(zhuǎn)Drosha酶特異性siRNA的基礎(chǔ)上約增加1倍，即從現(xiàn)有的5%～15%提高到30%以上(圖3)。

A: Relative expression of B-cell surface markers (CD80 and CD86) on B cells following cultured 24 h with α-CD180 or LPS. B: Relative expression of plasma cell surface markers (CD138) of cultured B cells following cultured 72 h with α-CD180 or LPS (Gray: Naive B cell. Blue: Stimulated with LPS. Red: Stimulated with α-CD180).

A: Efficiency of Drosha specific siRNA was detected by Western Blot in plat E cells. B and C: Transduction efficiency of B cells using retrovirus packaged without or with gradient concentration of Drosha specific siRNA during transfection. Transduced B cell showed as Ametrine+.

Transduced B cell showed as Ametrine+.

2.4 受體鼠預(yù)感染可顯著提高過繼轉(zhuǎn)移后B細(xì)胞收獲的數(shù)量

VI10小鼠繁殖較為困難，因此B細(xì)胞體外轉(zhuǎn)導(dǎo)后，如何盡可能少地過繼轉(zhuǎn)移B細(xì)胞是提升實驗效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[27]。VI10YEN小鼠的B細(xì)胞特異性識別VSV抗原，過繼轉(zhuǎn)移至野生型受體小鼠后，可在VSV感染時強烈增殖和分化，最終產(chǎn)生特異性抗體[28]。以往研究都是在過繼轉(zhuǎn)移的同時或之后用VSV感染受體鼠，考慮到B細(xì)胞增殖和分化是一個連續(xù)的過程，本實驗嘗試在VSV預(yù)先感染受體鼠后再過繼轉(zhuǎn)移病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞。如圖4所示，在過繼轉(zhuǎn)移前預(yù)先感染VSV的小鼠(pre-infection)脾臟中，可檢測到的VI10YEN B細(xì)胞數(shù)量持續(xù)高于過繼轉(zhuǎn)移同時感染(syn-infection)的小鼠。因此，受體鼠預(yù)感染可收獲更多增殖、分化的B細(xì)胞以供后續(xù)表型分析，如此極大節(jié)省了實驗材料并減輕了工作量。

2.5 通過敲低B細(xì)胞目的基因表達(dá)確定基因功能方法的驗證

經(jīng)過以上環(huán)節(jié)的優(yōu)化，用NIH/3T3細(xì)胞在體外篩選得到了2個有效敲低B細(xì)胞抗凋亡分子Bcl6的shRNA(圖5A)。使用相同方法轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞后將其過繼轉(zhuǎn)移至受體鼠，6 d后進(jìn)行檢測，實驗流程如圖5B。發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移前后，轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl6 shRNA 的VI10YEN B細(xì)胞(Ametrine陽性)與對照shRNA相比在總過繼轉(zhuǎn)移的B細(xì)胞中占比稍有下降，但在免疫6 d后，其比例下降尤其顯著(圖5C)，3次實驗結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5D)。這一結(jié)果與之前報道的Bcl6在B細(xì)胞分化過程中抗凋亡的作用相一致[19]。

A: VI10 B cells (CD45.1/2) were transferred to pre-infected mice(Pre-infection) or to mice infect VSV simultaneously (Syn-infection). Detect the CD45.1/2 cells at different time points. B: The proportion and total number of CD45.1/2 cells in all lymphocytes (100,000 total) are shown in (B) and (C), respectively.

3 討論

為探究抗病毒體液免疫反應(yīng)中眾多未被闡明的基因功能，本研究構(gòu)建了一種通過反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的shRNA對原代B細(xì)胞進(jìn)行功能基因敲低的方法。通過共轉(zhuǎn)染Drosha酶特異性siRNA制備攜帶shRNA的反轉(zhuǎn)錄病毒，2次離心感染CD180抗體激活的VSV特異性原代B細(xì)胞，最終可獲得約30%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。這些轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在過繼轉(zhuǎn)移至預(yù)先使用VSV感染的C57BL/6小鼠后可在體內(nèi)增殖、分化并表現(xiàn)出目的基因敲低的表型。

本研究提供的原代B細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方法相較之前的研究有以下幾個方面的改進(jìn)。①為提高含有shRNA的反轉(zhuǎn)錄病毒RNA的穩(wěn)定性，在包裝病毒時共轉(zhuǎn)染了Drosha酶特異性siRNA，這可以顯著提高B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。②對維持B細(xì)胞增殖活化的刺激劑進(jìn)行了改進(jìn)。B細(xì)胞只有在增殖的情況下才能被反轉(zhuǎn)錄病毒感染，目前激活B細(xì)胞的方式有LPS、IL4+CD40L、anti-IgM F(ab) BCR 交聯(lián)以及CD180抗體與B細(xì)胞共培養(yǎng)[10]，但只有CD180抗體是較為合適的刺激劑[25]，它可以在體外通過Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)4有效激活B細(xì)胞并維持B細(xì)胞存活，但不使其分化為漿細(xì)胞，適用于體外激活原代B細(xì)胞；值得注意的是，高營養(yǎng)的培養(yǎng)基也對原代B細(xì)胞增殖至關(guān)重要[29]。③對B細(xì)胞而言，離心感染2次可顯著提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。④為保持B細(xì)胞在體內(nèi)最大的增殖能力，對VSV感染小鼠和過繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞的先后次序進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，預(yù)先免疫可使過繼轉(zhuǎn)移的B細(xì)胞有更強烈的增殖，也可獲得更多數(shù)量的轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞以供分析。這可能是由于預(yù)先感染VSV可激活體內(nèi)其他輔助細(xì)胞，如CD4+T細(xì)胞等，為B細(xì)胞的增殖和分化提供了必要的輔助因子。

綜上所述，通過對以上步驟的改良，系統(tǒng)地建立了一種有效敲低原代B細(xì)胞中目的基因表達(dá)以快速鑒定基因功能的方法。該方法可用于B細(xì)胞增殖、分化過程中基因功能的鑒定，也可作為較大規(guī)?；蚯贸∈髽?gòu)建前功能基因的初步篩選，為研究病毒感染中B細(xì)胞的增殖、分化機制及其存在的缺陷打下了良好基礎(chǔ)。

A: Expression of Bcl6 in transduced NIH/3T3 cells was detected by Western Blot **：P<0.001. B: Schematic diagram of the experiment. C: Analysis of transduced cells proportion before and after adoptive transfer. D: Proportion of Bcl6 shRNA-transduced cells relative to Ren.713 shRNA-transduced cells. *：P<0.05