蔡霞，韓文東，孫志平，錢韻，陳力，謝幼華，瞿滌,

1. 復旦大學生物安全三級實驗室, 上海 200032; 2. 復旦大學上海醫(yī)學院基礎醫(yī)學院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學分子病毒學重點實驗室, 上海 200032

2019年12月以來多個國家陸續(xù)出現(xiàn)了新型冠狀病毒感染的肺炎疫情，我國將此類病例納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，按甲類傳染病管理[1]。2020年1月30日世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)宣布這次新型冠狀病毒疫情為國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[2]。2020年2月11日，國際病毒分類委員會宣布將此新病毒命名為“嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”；WHO宣布這一新疾病的名稱為“2019冠狀病毒病” (corona virus disease 2019，COVID-19)[3]。2020年3月12日WHO再次宣布COVID-19為全球大流行病(pandemic)[4]。在疫情防控中，實驗室在患者的病原診斷以及有關藥物和疫苗的研發(fā)中發(fā)揮著不可忽視的作用。為了保證實驗室的生物安全，國家衛(wèi)生健康委員會(簡稱衛(wèi)健委)發(fā)布了《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》(簡稱《指南》)[5]，將新型冠狀病毒暫時按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理?！吨改稀访鞔_指出：病毒培養(yǎng)、動物感染實驗等操作應當在生物安全三級(biosafety level 3,BSL-3)實驗室內進行；未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作以及臨床樣本的滅活等操作應當在BSL-2實驗室進行，同時采用BSL-3實驗室的個人防護[5]。面對此次突發(fā)的SARS-CoV-2感染疫情，及時、安全地啟動并穩(wěn)定運行BSL-3實驗室，為科研攻關提供安全、可靠的技術平臺，是對實驗室應急能力的考驗。在此, 將復旦大學BSL-3實驗室緊急啟動并保障新冠病毒研究安全進行的體會總結如下。

1 復旦大學BSL-3實驗室緊急啟動和日常運行

復旦大學BSL-3實驗室于2020年1月24日(除夕)接到上海市衛(wèi)健委及復旦大學下達的任務后緊急啟動。在短暫的3 d內準備好申報新型冠狀病毒實驗(包括風險評估及相關實驗操作程序等)的資料。資料經(jīng)復旦大學生物安全專家委員會審核并經(jīng)校生物安全委員會主任(校長)批準，由上海市衛(wèi)健委上報國家衛(wèi)健委。 實驗室于1月28日和 30日先后獲得中國合格評定國家認可委員會 (China National Accreditation Service for Conformity Assessment, CNAS)和國家衛(wèi)健委批準進行新型冠狀病毒實驗；同時對新型冠狀病毒研究攻關成員進行強化培訓，為及時從來自上海的患者樣本中分離病毒提供了實驗平臺。在此次實驗室應急啟動中，復旦大學BSL-3實驗室充分體現(xiàn)了“戰(zhàn)時一分鐘，戰(zhàn)前十年功”的精神。

1.1 復旦大學BSL-3實驗室的建設背景及日常運行

復旦大學BSL-3實驗室是上海市及復旦大學的高致病性微生物研究平臺，其作用定位于科研和教育。2002年在聞玉梅院士的建議下，復旦大學BSL-3實驗室作為復旦大學“211”重點學科建設項目立項。2008年9月復旦大學BSL-3實驗室通過CNAS生物安全實驗室評審，并獲得衛(wèi)生部(現(xiàn)國家衛(wèi)健委)批準的實驗活動資格，可進行包括結核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒、甲型流感病毒(H1N1)、中東呼吸綜合征冠狀病毒、高致病性禽流感病毒、布魯菌屬等病原的操作及動物感染實驗。實驗室的3個核心區(qū)經(jīng)常同時開放，3～4個項目組進入，故而生物安全管理面臨很大的挑戰(zhàn)。依據(jù)我國的法律、法規(guī)及上海市相關規(guī)定，結合自身特點，復旦大學BSL-3實驗室建立了BSL-3實驗室生物安全管理體系，加強了BSL-3實驗室內涵建設。通過十多年的安全運行，特別是在進行呼吸道傳播病原〔如高致病性禽流感病毒(H7N9)、結核分枝桿菌〕實驗項目的管理中，積累了豐富的實際工作經(jīng)驗(每年開機時間見圖1)，為迅速開展SARS-CoV-2實驗奠定了堅實的基礎。

1.2 BSL-3實驗室應急狀態(tài)下必須依法管理

本次疫情中，復旦大學BSL-3實驗室在短暫的數(shù)天內能獲得資質并開展SARS-CoV-2攻關實驗，也是基于我們對法律、法規(guī)以及申請流程的熟悉。我國對BSL-3實驗室及其實驗活動施行嚴格的管理制度，合法、合規(guī)地開展實驗是實驗室安全運行的基礎。即使在緊急狀態(tài)下開展的實驗也必須符合國家及地方的法律、法規(guī)。我國對BSL-3實驗室的管理有“規(guī)定多，要求嚴，變化快”的特點，只有“平時”熟悉各種法律、法規(guī)，才能在“戰(zhàn)時”(緊急狀態(tài))不踩法律紅線，確保各項實驗在法律規(guī)定范圍內進行。目前，《中華人民共和國傳染病防治法》是我國進行生物安全實驗室管理的主法。根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》，國務院出臺了《病原微生物實驗室生物安全管理條例》(國務院424號令)等相關行政法規(guī)，各部委也相繼出臺了多部規(guī)章以規(guī)范實驗室的各項活動。同時，各地根據(jù)自身的特點制定了地方性法規(guī)。此外，CNAS等機構還制定了各種國家標準、行業(yè)標準。復旦大學BSL-3實驗室平時注重與國家及上海市有關主管部門的溝通和聯(lián)系，加強與中國疾病預防控制中心的業(yè)務合作，及時咨詢并獲得新的信息。同時定期組織實驗室人員學習相關法律、法規(guī)，熟悉國家及地方關于實驗室管理的各項規(guī)定和準則，及時關注新發(fā)布的各項規(guī)范并內化為實驗室日常管理制度或程序，確保在應急狀態(tài)下能合法、合規(guī)地開展活動。

注：根據(jù)國標GB19489-2008要求，2011年對BSL-3實驗室進行轉換整改，因此當年開機時間較短。

2 BSL-3實驗室在疫情中的快速應答與內涵建設

在接到任務后，復旦大學BSL-3實驗室于2020年1月24日緊急啟動申報開展新型冠狀病毒實驗的資格流程；1月25日檢查實驗室設施設備運行的安全性；同時對攻關組成員進行新型冠狀病毒風險評估，以及生物安全、個人防護裝備佩戴和穿脫、污染廢物處置等方面的強化培訓。1月30日實驗室獲得了開展新型冠狀病毒實驗的資格，攻關組于2月7日從來自上海患者的樣本中分離到COVID-19病毒株[6]。BSL-3實驗室在疫情中的快速應答體現(xiàn)了實驗室平時軟實力(即內涵)的建設，包括實驗室日常管理、人員培訓管理以及實驗技術儲備等。復旦大學BSL-3實驗室根據(jù)自身特點，對實驗室的所有活動制訂了切實可行的、系統(tǒng)的體系文件，涉及組織機構和人員管理、文件與檔案管理、微生物危害評估、樣品和菌(毒)種管理、病原微生物安全操作等內容。同時，根據(jù)平時的實驗活動，實驗室還制訂了相應的制度和操作程序，并根據(jù)具體情況的改變及時修訂文件，以保證實驗室各項活動有條不紊地進行，并在應急時順利開展各項實驗。

2.1 BSL-3實驗室的設立單位建立完善的管理體系

復旦大學BSL-3實驗室的設立單位是復旦大學，并由復旦大學下?lián)芙?jīng)費支持。為保證實驗室的正常運行并在緊急時刻能及時啟動，復旦大學建立了一套包括校長、書記及各相關職能部門在內的管理體系。針對此次疫情，復旦大學立即成立了新型冠狀病毒攻關領導小組，校長授權領導小組組長進行管理。在領導小組下成立了新型冠狀病毒項目管理組、攻關組、平臺組(BSL-3實驗室)以及專家組，并制訂了新型冠狀病毒項目管理流程(圖2)和相關實驗申請流程(圖3)，項目管理的原則是“生物安全一票否決制”。

圖3 復旦大學BSL-3實驗室開展新型冠狀病毒實驗的申請流程

圖2 復旦大學新型冠狀病毒項目管理流程

復旦大學BSL-3實驗室的管理實行校長領導下的生物安全管理委員會負責制，并由多個職能部門配合。實驗室同時接受來自CNAS、國家衛(wèi)健委等上級主管部門和上海市相關部門的監(jiān)督和管理、業(yè)務指導和技術支持。復旦大學建立了以聞玉梅院士為主任的生物安全專家委員會，負責為所涉及高致病性病原微生物的研究工作提供技術咨詢及審核，以保障實驗室能安全進行相關研究。此次疫情中，生物安全專家委員會為新型冠狀病毒研究工作的方案、操作程序進行生物安全審查并提供技術咨詢，保障了實驗安全、平穩(wěn)、高效地進行。

2.2 BSL-3實驗室風險評估和管理

風險評估是實驗室生物安全管理的核心[7]。

SARS-CoV-2為新現(xiàn)病原體，在疫情發(fā)展初期，其傳播途徑、存活能力等特性并不確定，開展實驗存在較大的潛在風險，因此對SARS-CoV-2實驗的風險評估和管理對于實驗室風險管控至關重要。由于本室長期開展經(jīng)呼吸道傳播的高致病性禽流感病毒H7N9等實驗項目，在進行H7N9相關的實驗中積累了經(jīng)驗，從而為此次SARS-CoV-2實驗風險點的識別及風險控制措施的制訂奠定了良好的基礎。

《病原微生物實驗室生物安全通用準則》(WS 233-2017)指出：“實驗室應建立并維持風險評估和風險控制制度，應明確實驗室持續(xù)進行風險識別、風險評估和風險控制的具體要求”[8]。復旦大學BSL-3實驗室根據(jù)從事的高致病性病原微生物特點及操作過程中可能產(chǎn)生的生物危害，建立了一套實驗室生物危害風險評估的管理體系，從而為此次順利開展SARS-CoV-2的研究工作夯實了基礎。實驗風險評估由實驗室主任和生物安全負責人組織，實驗室生物安全委員會委員、相關專家及工作人員參加。風險評估的內容包括實驗可能涉及的所有環(huán)節(jié)，如：實驗涉及的致病性生物因子的特性、操作過程、安全管理的風險、操作人員的風險、實驗室設施和設備等。由于病原微生物信息不斷更新以及生物安全實驗室的變更等因素，風險評估是一種動態(tài)發(fā)展的工作，需及時更新。風險評估進行更新時，由復旦大學生物安全委員會指派實驗室生物安全負責人組織。生物安全負責人收集相關致病性病原微生物危害程度的最新資料，同時組織專家對疑難問題進行討論。

2.3 SARS-CoV-2的風險評估及管理

COVID-19疫情發(fā)生后，本實驗室在啟動緊急申報任務的同時，立即組織人員(包括攻關組成員)對SARS-CoV-2相關的實驗進行風險評估。SARS-CoV-2主要通過飛沫或與感染者密切接觸傳播，在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能[1, 9]。根據(jù)SARS-CoV-2的這一傳播特性，實驗人員在進行相關實驗時加強了呼吸道及黏膜的個人防護，按要求佩戴N95口罩以及正壓通氣面罩或護目鏡。并且根據(jù)具體情況，在實驗中對關鍵環(huán)節(jié)的風險進行再評估。在此次SARS-CoV-2相關實驗過程中，發(fā)現(xiàn)該病毒的感染劑量較低，因此實驗人員在擴增病毒時應加強個人防護并提高防護意識。根據(jù)這一情況，實驗室重新修訂了針對SARS-CoV-2的個人防護標準作業(yè)程序(Standard Operating Procedure，SOP)，并對實驗人員進行了再培訓，以控制風險。

與H7N9病毒不同，SARS-CoV-2對下呼吸道損害嚴重，其細胞表面受體為血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)。ACE2在人肺泡上皮細胞和小腸上皮細胞中表達最為豐富，并在器官的動脈和靜脈內皮細胞及動脈平滑肌細胞中表達[10]，表明該病毒不僅較易引起人體感染，同時可能感染多個細胞系(部分表達ACE2的細胞見表1)。因此，在進行SARS-CoV-2相關實驗時，強調不僅需要加強實驗人員的個人防護，同時還要特別關注所使用的細胞系。實驗過程中使用的細胞系必須為無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，禁止使用可能含有其他病原體的細胞系，以防止不同病毒發(fā)生重組。

表1 部分表達ACE2的細胞

2.4 應急狀態(tài)下BSL-3實驗室的管理

BSL-3實驗室在疫情應急狀態(tài)下的有效管理是基于實驗室的日常管理。只有日常管理到位，才能在應急時安全、高效、有序地開展實驗。在涉及SARS-CoV-2的研究中，攻關組和平臺組雙方指定生物安全負責人，及時溝通實驗及實驗中出現(xiàn)的狀況，并解決問題，在保證實驗室和人員安全的情況下推動實驗的順利進行。實驗室也對各種緊急情況制訂應急預案、組織模擬演練并及時總結和優(yōu)化。同時，建立關鍵崗位人員替代制度，在指定人員無法及時到位的情況下，替代人員需及時補位。此次COVID-19疫情發(fā)生時，正值春節(jié)期間，在部分實驗室工作人員無法及時到位的情況下，替代人員迅速補位，保證了SARS-CoV-2相關實驗的順利開展。

2.5 應急狀態(tài)下BSL-3實驗室人員的培訓及管理

人是實驗室生物安全管理的第一要素。根據(jù)國家規(guī)定，BSL-3實驗室的工作人員需經(jīng)過CNAS及衛(wèi)生主管部門現(xiàn)場評審專家組及相關主管部門的考核并備案方可進入實驗室工作[13]。

2.5.1 SARS-CoV-2實驗人員的培訓為了降低實驗室感染的潛在風險[14]，需及時、定期開展實驗人員生物安全培訓，以保證項目的順利進行。復旦大學BSL-3實驗室是復旦大學的高致病性病原微生物研究平臺，有不同項目組的人員進入實驗室進行操作，因此實驗室平時需要對不同背景的項目組人員進行有針對性的相關專業(yè)知識及技術培訓，及時更新培訓內容，針對薄弱環(huán)節(jié)開展多種形式的反復培訓與演練，項目組人員只有通過實驗室的培訓及考核后方可進行實驗。對于獲得上崗證的項目組，實驗室指定BSL-3生物安全負責人對項目組進行定期或不定期的監(jiān)督，以便及時發(fā)現(xiàn)問題，指導其對所存在問題進行風險分析并整改，禁止不符合要求的實驗人員進入實驗室開展實驗。COVID-19疫情發(fā)生后，國家衛(wèi)健委、CNAS等針對新現(xiàn)病原及時發(fā)布各項規(guī)定、指南等文件，中國疾病預防控制中心的專業(yè)部門也發(fā)布各種關于新現(xiàn)病原的病原學、防控措施等信息。BSL-3實驗室及時收集此類信息并制訂相應的操作方案，開展風險評估，組織項目組實驗操作人員進行相關知識的培訓，包括對于新現(xiàn)病原的各種防護及實驗技術操作培訓；同時對項目組人員進行理論及操作考核，考核通過后方可進行涉及SARS-CoV-2的實驗。在相關實驗過程中，BSL-3實驗室工作人員對實驗人員進行監(jiān)督，及時發(fā)現(xiàn)和糾正問題。當發(fā)現(xiàn)存在比較大的風險隱患時，召開項目組人員與BSL-3實驗室人員聯(lián)席會議，提出實際可行的、有針對性的解決方案。

2.5.2 新型冠狀病毒攻關組的管理本次COVID-19疫情中，參與SARS-CoV-2相關實驗的項目組成員由復旦大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點實驗室和病原生物學系不同課題組的骨干人員臨時組成。在項目組中不同課題組成員間開展協(xié)調工作是對本實驗室應急管理能力的考驗，順利通過考驗離不開實驗室平時在項目組管理中的經(jīng)驗積累。不同于疾病預防控制中心系統(tǒng)的BSL-3實驗室，復旦大學BSL-3實驗室平時的實驗以科研與教學為主，對來自不同單位的項目組開放，有不同的研究人員進入。每年有 6～7個項目組進入BSL-3實驗室開展實驗(包括人類免疫缺陷病毒的細胞感染實驗以及結核分枝桿菌、高致病性禽流感病毒H7N9、布魯菌的細胞及動物感染實驗)。由于項目組人員的背景不同，因此需要對項目組進行管理。本次SARS-CoV-2的實驗主要以復旦大學醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點實驗室為主的SARS-CoV-2攻關組負責，我們平時積累的項目組管理流程和經(jīng)驗發(fā)揮了作用，保證了實驗的順利進行。

2.5.3 BSL-3后勤保障人員的培訓及管理復旦大學BSL-3實驗室日常運行需要后勤保障人員對實驗室進行維護。后勤保障人員(包括維護公司的人員)未經(jīng)允許不能進入BSL-3實驗室核心區(qū)。經(jīng)過許可進入指定的實驗室核心區(qū)的后勤保障人員必須熟悉實驗室的安全操作規(guī)程及最新的生物安全防護知識，了解進入實驗室核心區(qū)的潛在危險，經(jīng)過培訓取得上崗證后在BSL-3實驗室工作人員的陪同下方可進入核心區(qū)。在COVID-19疫情暴發(fā)時，由于后勤保障人員平時對實驗室核心區(qū)非常了解，可以盡快進入實驗室進行系統(tǒng)調試，為開展SARS-CoV-2的相關實驗爭取了寶貴的時間。

2.6 BSL-3實驗室針對SARS-CoV-2的實驗技術儲備

實驗技術的積累是BSL-3實驗室順利、高效開展實驗的技術保障。在高等級生物安全實驗室的日常運轉中，工作人員需具備完備的專業(yè)知識和良好的操作技能，特別是科研人員須擁有精湛的微生物實驗操作技術，方可降低發(fā)生生物安全事故的可能性[15]。只有了解相關病原的操作，才能識別關鍵風險環(huán)節(jié)，制定可行的風險控制措施。因此，BSL-3實驗室人員應了解和熟悉在本實驗室開展的相關病原微生物實驗操作及流程。復旦大學BSL-3實驗室人員在負責實驗室安全運行管理的同時，經(jīng)常向項目組人員學習并進行交流。復旦大學BSL-3實驗室與基礎醫(yī)學院醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點實驗室和病原生物學系已建立密切的合作關系，即BSL-3實驗室為重點實驗室提供高致病性病原微生物研究平臺，重點實驗室為BSL-3實驗室提供技術支持。在此次COVID-19疫情中，雙方的優(yōu)勢得以充分發(fā)揮，使得項目組能夠快速從患者樣本中分離到SARS-CoV-2毒株，并形成了規(guī)范操作程序等文件。BSL-3實驗室團隊與攻關團隊在實踐中互相學習，共同提高。

2.7 BSL-3實驗室設施和設備的保障

2.7.1 BSL-3實驗室設施設備運行的管理本實驗室在緊急情況下能夠平穩(wěn)啟動并安全地開展實驗，軟實力是保障，而硬件是基礎。本次疫情發(fā)生時，正值實驗室停機檢修階段(包括對實驗室維護結構的嚴密性檢測，實驗室防護區(qū)的換氣次數(shù)檢測，壓力、溫度、濕度傳感器校準，送風高效過濾器更換等)，能夠在短時間內完成檢修并緊急啟動，離不開平時長時間運行中的經(jīng)驗積累(實驗室設施、設備的安全運行對于實驗室的安全運行非常重要，具體經(jīng)驗將另文介紹。)

2.7.2 實驗室設施系統(tǒng)維護與應急響應復旦大學BSL-3實驗室系統(tǒng)的運行與管理分為3個層級，包括日常運行管理、維護保養(yǎng)(周、月、季和年)管理以及年度檢測。設施系統(tǒng)的維護、維修委托維保公司進行，實驗室的設施負責人進行監(jiān)督、檢查。維護方案由實驗室與維保公司共同制訂。系統(tǒng)出現(xiàn)問題時，維保公司人員必須在2 h內到達現(xiàn)場進行維修。同時，實驗室生物安全設施系統(tǒng)須按規(guī)定通過第三方檢測機構的年度檢測[16]。實驗室日常的及時維護和檢測可保障實驗室在疫情發(fā)生時緊急啟動并平穩(wěn)運行。此次緊急啟動中，維保公司在正月初一即派員到位啟動實驗室并進行調試，保證了實驗室的正常、安全運轉。

2.7.3 BSL-3實驗室關鍵設備的維護實驗室開展高致病性病原微生物實驗離不開諸如恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、生物安全型離心機、生物安全柜等儀器設備的穩(wěn)定運行，且核心工作間配置的儀器設備與普通實驗室在生物安全要求方面有所區(qū)別。根據(jù)日常實驗開展的情況，應及時添置符合實驗需要且滿足生物安全要求的儀器設備，以防疫情緊急狀態(tài)下采購儀器設備受阻，影響實驗的順利開展。此外，核心區(qū)工作間處于負壓通風狀態(tài)，并受換氣次數(shù)(每小時不少于12次[17])的影響，儀器設備容易出現(xiàn)故障。因此，平時需對儀器設備及時進行維護、校準和調整，以確保在應急響應時處于正常工作狀態(tài)。

2.7.4 BSL-3實驗室防護用品的儲備BSL-3實驗室的各類防護用品是實驗室順利開展實驗的必備耗材，且多為一次性使用。因此實驗室必須儲備一定數(shù)量的個人防護用品，如防護性口罩、一次性防護服、靴套等。實驗室應根據(jù)平時實驗開展的情況，對防護用品的消耗情況計算、統(tǒng)計并及時補充。本實驗室一般儲備可用3～6個月的防護用品，以備疫情突發(fā)時急需。此次疫情中，在各方防護用品告急的情況下，本實驗室因提前儲備了防護用品及實驗耗材，滿足了SARS-CoV-2攻關組在開展實驗時的需求。

3 結語

應急能力體現(xiàn)了BSL-3實驗室平時的內涵建設。在實驗室日常運行中，通過不斷發(fā)現(xiàn)、糾正或整改問題，逐步優(yōu)化管理體系以達到高效解決實際問題的水平；經(jīng)BSL-3實驗室工作人員團隊和項目組成員之間的磨合，不斷積累經(jīng)驗和提升能力，在緊急時刻才能迅速響應并保證實驗室的安全運行。BSL-3實驗室的硬件是實驗室安全、有效運行的基礎，而內涵建設是保障，雙管齊下方能保證實驗室安全、高效地運轉。實驗室內涵建設是軟實力，涉及管理系統(tǒng)、風險評估、人員管理等多個方面。在實驗室平時活動中，營造生物安全文化，提高生物安全意識，為應急能力建設奠定基礎。BSL-3實驗室運行過程中，會發(fā)生不同的問題，只有及時發(fā)現(xiàn)并找出解決的方案或方法并加以總結及優(yōu)化管理體系，才能在應急響應時減少事故的發(fā)生，為疫情控制、科研攻關提供技術支撐和生物安全平臺保障。