汪穎楠，依鳴，徐維禎，鐘照華

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室， 哈爾濱 150081

柯薩奇病毒B組(Coxsackievirus B，CVB)是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬成員，基因組為長(zhǎng)7.4 kb的單股正鏈RNA(+ssRNA)[1]，編碼一個(gè)大分子前體蛋白，被自身編碼的蛋白酶2APro、3CPro逐級(jí)切割，最終形成4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4)和7個(gè)功能蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)[2-4]，其中，3D是病毒的RNA依賴(lài)性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，為病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶[5-6]。

CVB在復(fù)制傳代過(guò)程中存在基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象。研究顯示，在感染小鼠心臟組織中發(fā)現(xiàn)了5′端7～49個(gè)堿基缺失的CVB3基因組RNA，并證明缺失RNA與全長(zhǎng)基因組的混合物可在宿主體內(nèi)復(fù)制并持續(xù)存在[7]。本課題組前期的研究也顯示，插入外源增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)基因的CVB3-eGFP重組毒株在感染細(xì)胞后，病毒基因組RNA出現(xiàn)剪切和拼接[8]。由此推測(cè)CVB感染可能會(huì)產(chǎn)生不完整的基因組剪切片段，但目前尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明，因此CVB基因組剪切的序列特點(diǎn)和機(jī)制均不清楚。

cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)原理的cDNA末端片段擴(kuò)增方法[9]，可用于cDNA的3′和5′端擴(kuò)增，其中5′ cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE, 5′ RACE)以cDNA為模板，利用3′端已知序列為引物，擴(kuò)增獲得第1條鏈后，在其5′端添加人工接頭，以人工接頭序列為5′引物，完成PCR擴(kuò)增。本研究利用5′ RACE，從CVB感染細(xì)胞中擴(kuò)增和克隆病毒基因組3′端片段，分析CVB基因組剪切序列的特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究CVB基因組的剪切和生物學(xué)意義提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa細(xì)胞、CVB3 Woodruff毒株、3D抗體來(lái)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室。內(nèi)參GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)于萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，CVB全基因cDNA克隆質(zhì)粒pMKS1由J. Linsay Whitton教授(美國(guó)Scripps Research Institute)惠贈(zèng)。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq聚合酶、SMARTer RACE 5′/3′試劑盒、凝膠回收試劑盒與In-Fusion HD Cloning Kit購(gòu)于日本TaKaRa公司，TRIzol和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，10% PAGE凝膠試劑盒購(gòu)于美國(guó)EpiZyme公司，CDP-Star顯色液購(gòu)自哈爾濱欣科瑞有限公司，探針及引物合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，測(cè)序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)5′ RACE擴(kuò)增的上游引物為通用引物，序列為5′-CTAATACGACTCACTATA-GGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′。為獲得編碼區(qū)完整的剪切片段，依據(jù)CVB3基因組3′非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)序列，經(jīng)Gene Runner軟件設(shè)計(jì)下游特異性引物。為便于后續(xù)In-fusion克隆，下游引物5′ 端引入特定堿基序列GATTACGCCAAGCTT。下游引物序列：5′-GATTACGCCAAGCTTTGCACCGTTGTCTAG-TTCGGTTAGTACAGTAGGGTTAAGCCAAT-3′。

1.2.2 感染細(xì)胞總RNA的提取將HeLa細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(1×106/孔)，37 ℃、 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為80%～90%時(shí)，更換新鮮完全培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)孔加2 μL CVB3液(TCID50= 10-4.75/0.1 mL)；孵育1 h后，換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后收取細(xì)胞沉淀。參照TRIzol說(shuō)明書(shū)操作提取感染細(xì)胞總RNA。收集的感染細(xì)胞沉淀物中加入TRIzol試劑并混勻，加入氯仿進(jìn)行相分離，取水相加入異丙醇沉淀RNA，經(jīng)75%乙醇洗滌沉淀物，用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)水溶解獲得總RNA。

1.2.3 通過(guò)5′ RACE及In-fusion克隆獲取剪切片段序列RNA與通用引物混合，72 ℃孵育3 min，42 ℃冷卻2 min，14 000×g離心10 s。加入DTT、dNTPs、SMARTer Ⅱ A寡核苷酸及反轉(zhuǎn)錄酶混勻，42 ℃孵育90 min，70 ℃加熱10 min。加入10 mL Tricine-EDTA緩沖液稀釋cDNA產(chǎn)物。以cDNA為模板，進(jìn)行5′ RACE擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 變性30 s，68 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸3 min，共25個(gè)循環(huán)。凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，回收產(chǎn)物經(jīng)In-fusion連接酶與線(xiàn)性化pUC19載體50 ℃孵育15 min；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Stellar感受態(tài)細(xì)胞后涂布于Amp+LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)；隨機(jī)挑取單克隆菌落，接種于Amp+LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；提取質(zhì)粒，以pUC19質(zhì)粒為對(duì)照篩選的陽(yáng)性克隆，送北京睿博興科公司測(cè)序，測(cè)序引物為通用引物M13F及M13R。

1.2.4 Northern印跡(Northern blot)雜交實(shí)驗(yàn)HeLa細(xì)胞感染病毒后分別于0、12、24 h收獲細(xì)胞，提取RNA，用1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠分離，變性RNA轉(zhuǎn)印至陽(yáng)性尼龍膜，固定后預(yù)雜交，再加入地高辛標(biāo)記的探針雜交過(guò)夜，探針為DIG-UTP標(biāo)記的病毒3D編碼區(qū)一段200個(gè)核苷酸的片段。用含有0.1% 十二烷基硫酸鈉的0.1×枸櫞酸鈉鹽水(saline-sodium citrate，SSC)洗膜，封閉液常溫封閉1 h，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體0.5 μL，常溫孵育1 h，洗膜，加CDP-Star顯色液顯色。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法收取CVB3感染24 h的HeLa細(xì)胞并提取RNA和蛋白，使用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法對(duì)CVB3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書(shū)，依據(jù)CVB3基因組5′ UTR設(shè)計(jì)并合成特異性引物，以GAPDH基因作為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果。Western印跡法檢測(cè)蛋白：準(zhǔn)備10% PAGE凝膠，以每孔25 μL蛋白量上樣，預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)上樣量為10 μL。實(shí)驗(yàn)條件：120 V恒壓電泳2 h；300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min；室溫置封閉液中2 h；將膜置于1∶3 000稀釋的3D抗體及GAPDH抗體中，室溫孵育2 h；用含吐溫20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)洗3次；室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔二抗2 h；TBST洗5次；顯色并記錄結(jié)果。

1.2.6 基因序列分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST、ApE 及DNAMAN軟件比對(duì)分析并繪制模式圖。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)由RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)在線(xiàn)完成。

2 結(jié)果

2.1 CVB3基因組存在基因剪切片段

HeLa細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)用CVB3液感染，24 h后收取細(xì)胞沉淀物，分別提取感染細(xì)胞總蛋白和總RNA。Western印跡檢測(cè)到病毒3D蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為 58 000(圖1A)；RT-qPCR顯示，CVB3 RNA高表達(dá)(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)；Northern印跡檢測(cè)顯示，在病毒感染后12、24 h，CVB3的基因組中出現(xiàn)剪切片段并且有固定的條帶分布，非隨機(jī)剪切的產(chǎn)物(圖1C)。

A: Western blot for 3D protein in the HeLa cells infected with CVB3 for 24 h. B: RT-qPCR for CVB3 RNA in the HeLa cells infected with CVB3 at 24 h. *: P<0.01, unpaired t test. C: Northern blot for CVB3 genomic RNA in the HeLa cells infected with CVB3 for 0，12，24 h.

2.2 獲得CVB3基因組剪切片段及基因序列

感染細(xì)胞總RNA通過(guò)去RNA酶反應(yīng)和連接5′ RACE接頭序列后，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 模板，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳。結(jié)果顯示，2 500～7 500 bp區(qū)域可見(jiàn)大小不同的多條擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(圖2A)。依據(jù)課題組前期預(yù)測(cè)，回收2.0與7.5 kb之間所有的目的基因片段。

凝膠電泳回收目的基因片段，連接于pUC19線(xiàn)性載體，隨機(jī)挑取單克隆鑒定，對(duì)篩選出的20個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。這些RNA片段長(zhǎng)度在 2 067～5 547 bp之間，與預(yù)期相符。BLAST和DNAMAN分析顯示，所獲得的片段為病毒基因組的3′片段。與完整病毒基因組相比，缺少長(zhǎng)約793～5 144 bp的5′端序列。其中有5個(gè)片段的斷端位于CVB3基因組的2Apro編碼區(qū)，6個(gè)片段的斷端位于CVB3基因組的2C編碼區(qū)(圖2B)。除5′端基因缺失外，部分片段還出現(xiàn)序列丟失和拼接現(xiàn)象。如圖2B所示，20條片段基因序列中，有11條片段是CVB3基因組某一段的連續(xù)性基因片段，另9條為CVB3基因組非連續(xù)的拼接片段。

A: The gel electrophoresis of the 5′ RACE product, recover fragments ranging from 2.0～7.5 kb and cloned into pUC19. M1: DL15000 marker; 1: CVB genomic fragments; M2: wide-range 10 000 molecular weight marker. B: The position of the spliced fragments correspond the CVB3 full-length genome, and the number of start and stop bases.

2.3 CVB3基因組剪切片段斷端基因序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

以CVB3基因組為參照，分別選取20條片段的斷端位點(diǎn)上下游各100 bp堿基，應(yīng)用RNAfold預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，有9條剪切片段的斷端序列位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)上(圖3A)，有8條位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)附近或內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)上(圖3B)，還有3條剪切片段斷端序列未形成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3C)。

The secondary structure was predicted by selecting 100 bp around the starting position of the CVB genomic fragments (the position of the site was circled in red). A: The breakpoint sequence is located on the hairpin loop. B: The breakpoint sequence is near the hairpin structure or located on interior loop. C: No special structure.

3 討論

CVB是人類(lèi)病毒性心肌炎的主要病原體，可造成嚴(yán)重的心肌損傷及纖維化，為不可逆的擴(kuò)張型心肌病的致病原因之一。CVB基因組的5′ UTR含有特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)病毒RNA與宿主核糖體結(jié)合，啟動(dòng)病毒蛋白翻譯[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，在擴(kuò)張型心肌病患者心臟組織中，CVB3基因組部分5′ UTR有多個(gè)堿基缺失，可能與其持續(xù)感染相關(guān)。本課題組的前期研究推測(cè)CVB基因組在感染細(xì)胞過(guò)程中存在不穩(wěn)定現(xiàn)象[8]。

本研究通過(guò)Northern印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CVB3在感染細(xì)胞過(guò)程中可產(chǎn)生大量不完整的病毒RNA片段，5′ RACE擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了病毒基因組斷裂片段的序列特點(diǎn)，支持此前關(guān)于CVB在細(xì)胞中存在病毒基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象的推測(cè)。

從獲取的20條CVB3基因組片段分析可見(jiàn)，斷裂片段的5′端起點(diǎn)不是隨機(jī)分布，而是主要集中在2Apro和2C編碼區(qū)。斷裂片段中有11條為連續(xù)性序列，9條為非連續(xù)性拼接片段，提示斷裂片段在細(xì)胞中經(jīng)過(guò)了RNA編輯。因此，病毒基因組斷裂并非是提取核酸時(shí)機(jī)械性破壞造成的結(jié)果。

RNA剪接是真核細(xì)胞mRNA成熟過(guò)程中重要的一環(huán)，這個(gè)剪切和拼接機(jī)制也能用于病毒基因組RNA[14]。有報(bào)道稱(chēng)，甲型流感病毒復(fù)制過(guò)程中可使用剪接的mRNA增加病毒復(fù)制所需相關(guān)蛋白的數(shù)量[15-16]； 人類(lèi)免疫缺陷病毒基因組的轉(zhuǎn)錄本通過(guò)最佳剪接過(guò)程可產(chǎn)生40多種mRNA，用于產(chǎn)生前體蛋白或其他調(diào)節(jié)基因的單剪接mRNA[17]。研究表明， 宿主細(xì)胞中的Dicer、AGO2等RNA酶可識(shí)別病毒基因組特定序列或特定的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生小片段RNA并形成沉默復(fù)合物，靶向作用病毒RNA并降解[18-19]。本研究檢測(cè)到的是CVB3基因組來(lái)源的長(zhǎng)片段，對(duì)這些片段5′斷點(diǎn)附近序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果提示多數(shù)斷端位點(diǎn)可形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，局部形成雙鏈RNA，可能成為Dicer、AGO2等細(xì)胞RNA酶的靶序列。斷裂片段的產(chǎn)生機(jī)制有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)闡明。

病毒基因組還可被剪切產(chǎn)生有功能的小片段[20-21]，如Dicer可切割腸道病毒71型5′端序列，產(chǎn)生病毒源性小RNA(virus-derived small RNA，vsRNA)，并可反向作用于病毒基因組，干擾病毒復(fù)制。本研究發(fā)現(xiàn)的CVB3基因組RNA斷裂片段也可能被進(jìn)一步剪切，形成有生物學(xué)活性的小片段。本課題組另一項(xiàng)研究顯示，在CVB3感染的細(xì)胞中存在大量vsRNA，而且部分vsRNA可發(fā)揮miRNA樣作用，影響病毒復(fù)制(結(jié)果另文發(fā)表)。

本研究是一項(xiàng)初步探索性工作，僅以HeLa細(xì)胞為例，并且在簡(jiǎn)化感染條件下觀(guān)察CVB基因組的不穩(wěn)定性，結(jié)果證實(shí)了我們的推測(cè)。CVB在感染細(xì)胞(尤其是心肌細(xì)胞)的過(guò)程中，病毒基因組的穩(wěn)定性如何變化需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀(guān)察。本研究的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究CVB基因組的剪切和生物學(xué)意義提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。