薛曉婕，陳美周，張常亮，汪宏良

湖北省黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科), 腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室, 黃石 435001

2020年2月21日國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎防控方案(試行第五版)》指出，根據(jù)流行病學(xué)和病原學(xué)檢測研究發(fā)現(xiàn)，新出現(xiàn)的病毒性肺炎〔世界衛(wèi)生組織正式將其命名為2019冠狀病毒病(coronavirus disease 2019, COVID-19)〕由新型冠狀病毒〔國際病毒分類委員會正式將其命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)〕引起[1-4]，該病毒能發(fā)生人際傳播[5-6]。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[7]已明確，核酸檢測是臨床病原學(xué)確診的唯一方法。

但由于病毒在人體中的多樣性，不同時段的檢出率不同，如何確診核酸陰性而臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查均符合診斷要求的患者?如何通過實驗室相關(guān)檢測指標(biāo)提示疾病的轉(zhuǎn)歸？這些都是目前急需解決的問題。IgM是人體免疫系統(tǒng)最先產(chǎn)生的特異性抗體，提示近期有過感染，可用于早期診斷；IgG具有血中含量高、維持時間長、親和力高等特點，當(dāng)機(jī)體再次受感染時能迅速產(chǎn)生；白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)是炎癥感染指標(biāo)。本研究擬通過對SARS-CoV-2核酸、患者血清中IgM/IgG和IL-6的聯(lián)合檢測來評估其在SARS-CoV-2感染的診治和預(yù)后中的價值。

1 資料

1.1 病例納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

收集2020年1月29日—2月28日在鄂東醫(yī)療集團(tuán)就診的門診和住院患者113例作為病例組，其中男性67例、女性46例，年齡3～87歲。病例組中93例為COVID-19確診病例(核酸檢測陽性)，20例為疑似病例(核酸檢測陰性但臨床癥狀和CT檢測結(jié)果均符合)。確診病例中51例危重型，18例重型，15例輕型和9例普通型。選取來自兒科、婦科、腫瘤科、血液科和消化科等科室并排除COVID-19的患者110例作為對照組。其中男性54例、女性56例，年齡0.2～89歲。病人樣本的采集時間以起病至抗體采集的時間來計算。本研究遵守國際協(xié)調(diào)理事會臨床試驗規(guī)范和《赫爾辛基宣言》，經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會審核通過(倫理號：WDRY2020-K30)并批準(zhǔn)予以豁免患者知情同意。

2 方法

2.1 試劑與儀器

SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(深圳亞輝龍生物科技股份有限公司)，IL-6電化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(瑞士Roche公司)，新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(廣東達(dá)安基因公司)。所用儀器：iFlash3000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(深圳亞輝龍生物科技股份有限公司)，CobasE602全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀(瑞士Roche公司)，ABI7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(美國賽默飛公司)。

2.2 標(biāo)本采集

在發(fā)病后3～48 d內(nèi)采集患者空腹靜脈血2～3 mL，置于無抗凝劑的紅頭真空采血管內(nèi)，靜置待血液凝固，3 000×g離心5 min，取血清備用。采集研究對象的咽拭子標(biāo)本，進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測。

2.3 血清SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6的檢測

血清SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6檢測采用化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，其操作步驟與結(jié)果判定均嚴(yán)格按試劑盒說明書要求進(jìn)行。SARS-CoV-2 IgM或IgG的測試結(jié)果以相對發(fā)光強(qiáng)度(relative light unit，RLU)表示，檢測結(jié)果10.0 AU/mL為有反應(yīng)性(陽性)；IL-6以檢測結(jié)果7.0 Pg/mL為判讀標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 SARS-CoV-2核酸檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，檢測 SARS-CoV-2 基因組中開放讀碼框(open reading frame，ORF) 1ab和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)基因片段。SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果判讀以靶標(biāo)ORF1ab和靶標(biāo)N蛋白同時檢出為準(zhǔn)，CT值結(jié)果<40判定為陽性，≥40判定為陰性。靶標(biāo)ORF1ab和靶標(biāo)N蛋白均未檢出，則判定為陰性。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 SARS-CoV-2 IgM和IgG在COVID-19確診病例和疑似病例中的陽性檢出率較高

血清SARS-CoV-2 IgM和IgG在COVID-19疑似病例中的陽性率分別為85%和75%，在確診病例中分別為98.9%和95.7%(其中危重型分別為100%和100%，重型分別為94.4%和100%，輕型分別為100%和93.3%，普通型分別為100%和66.7%)，見表1。結(jié)果表明，SARS-CoV-2 IgM和IgG的聯(lián)合檢測在COVID-19患者特別是在核酸陰性的疑似臨床病例中具有非常高的檢出率，是核酸檢測漏檢的補(bǔ)充。

表1 SARS-CoV-2 IgM和IgG在COVID-19確診病例和疑似病例中的陽性檢出率

3.2 SARS-CoV-2 IgM和IgG在對照組的陽性檢出率較低

對照組的110例患者選自兒科、婦科、腫瘤科、血液科和消化科等科室并排除了COVID-19，檢測其SARS-CoV-2 IgM和IgG。結(jié)果顯示，3例患者SARS-CoV-2 IgM為弱陽性，2例SARS-CoV-2 IgG陽性。出現(xiàn)假陽性的原因可能與腫瘤、血液科患者存在自身免疫系統(tǒng)疾病、受SSA-60 等抗體影響有關(guān)。

3.3 SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6指標(biāo)與COVID-19的病情進(jìn)展有較強(qiáng)的相關(guān)性

113例研究對象在發(fā)病后3～48 d內(nèi)監(jiān)測其SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6。IL-6陽性率在危重型患者中為100%、在重型患者中為97.9%、在輕型患者中為5%、在普通型患者中為0%。將結(jié)果進(jìn)行比較，經(jīng)χ2檢驗，發(fā)現(xiàn)COVID-19患者血清中IL-6和SARS-CoV-2 IgM/IgG水平的變化與疾病的嚴(yán)重程度存在一定的關(guān)聯(lián)性， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=273.51，χ2=149.37；P<0.05)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清IL-6、SARS-CoV-2 IgM和IgG的聯(lián)合檢測對疾病的好轉(zhuǎn)有提示作用(見表2和表3)。

表2 SARS-CoV-2 IgM/IgG和IL-6在COVID-19確診病例和疑似病例中的檢出情況

表3 血清SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6表達(dá)水平在COVID-19不同臨床分型中的比較

4 討論

SARS-CoV-2是一種正鏈單股RNA冠狀病毒，基因組與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)不完全相同。在分類上與SARS-CoV相似， 同為β屬冠狀病毒B亞群(sarbecovirus亞屬)[8-11]。由于SARS-CoV-2感染具有較強(qiáng)的隱匿性，潛伏期長，臨床表現(xiàn)不一，根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》規(guī)定，只有臨床表現(xiàn)+影像學(xué)+病原學(xué)核酸檢測陽性才能夠確診[7,12]。因此，如何確診核酸檢測陰性而影像學(xué)診斷陽性、臨床表現(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)的COVID-19疑似病例給我們提出了一個巨大的挑戰(zhàn)。核酸標(biāo)本檢測的準(zhǔn)確性受到樣本采集與存放、病毒感染的部位、RNA的提取方法以及核酸檢測試劑盒的質(zhì)量問題等多方面因素的影響[13-14]，而血清或血漿標(biāo)本的采集和保存簡單、易行，且抗體在血清標(biāo)本中的穩(wěn)定性很好。病毒感染存在潛伏期，一般情況下，特異性IgM在發(fā)病后5～7 d出現(xiàn)，特異性IgG在發(fā)病后10～15 d出現(xiàn)。

本研究運(yùn)用SARS-CoV-2 IgM和IgG免疫檢測試劑盒對血清樣本進(jìn)行SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6的聯(lián)合檢測。研究發(fā)現(xiàn)，血清SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6在疑似病例中的檢出率分別為85%、75%和0%，在COVID-19確診病例中的陽性率分別為98.9%、95.7%和75.2%(其中危重型分別為100%、100%和100%，重型分別為94.4%、100%和97.9%，輕型分別為100%、93.3%和5%，普通型分別為100%、66.7%和0%)。結(jié)果提示，SARS-CoV-2 IgM和IgG聯(lián)合檢測在COVID-19患者特別是在核酸陰性的疑似臨床病例中具有非常高的檢出率。核酸陰性但I(xiàn)gM和IgG陽性提示患者可能近期曾感染SARS-CoV-2并處于恢復(fù)期，體內(nèi)病毒被清除，IgM尚未減低至檢測下限；或提示核酸檢測結(jié)果假陰性，患者處于感染活躍期。因此，血清SARS-CoV-2特異性抗體檢測與病毒核酸檢測可為良好互補(bǔ)，前者可協(xié)同核酸檢測，用于輔助診斷和快速篩查，其結(jié)果與相關(guān)研究相一致[15]。但SARS-CoV-2 IgM和IgG也會出現(xiàn)假陽性，這可能與體內(nèi)存在自身抗體、嗜異性抗體等有關(guān)：當(dāng)患有某些基礎(chǔ)疾病或免疫功能異?；蜷L期服用某種藥物時，機(jī)體可產(chǎn)生異常蛋白抗體或特殊物質(zhì)(如類風(fēng)濕因子、甲胎蛋白、補(bǔ)體等，均具有一定的非特異性吸附作用)。

在疾病的治療過程中，綜合分析患者的病癥及其血常規(guī)、D二聚體、血?dú)?分析氧飽和度)等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，隨著病情的好轉(zhuǎn)，SARS-CoV-2 IgM水平降低，SARS-CoV-2 IgG水平升高，血清IL-6值降低。病情惡化時，SARS-CoV-2 IgM持續(xù)增高，IL-6值也持續(xù)增高。研究表明，IL-6和SARS-CoV-2 IgM/IgG表達(dá)水平的改變與COVID-19患者疾病的嚴(yán)重程度存在一定的關(guān)聯(lián)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。綜上所述，血清IL-6和SARS-CoV-2 IgM/IgG的聯(lián)合檢測既可以作為COVID-19核酸檢測假陰性的有效補(bǔ)充，也可作為SARS-CoV-2感染診斷和治療評價的動態(tài)指標(biāo)。