鄭玉，張文哲，董利陽，王婷，汪雪峰

(江蘇大學附屬醫(yī)院中心實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

人源單核白血病細胞株THP-1細胞系是體外進行單核-巨噬細胞分化和功能、信號通路機制等研究的常用細胞系，能夠在體外誘導為巨噬細胞，最初從1例急性單核細胞性白血病患者外周血中分離獲得[1-2]。巨噬細胞作為一種重要的抗原呈遞細胞，參與炎癥反應(yīng)、癌癥及多種自身免疫或炎癥性疾病的病理改變[3]。

微RNA-21(microRNA-21，miR-21)是一類在多種哺乳動物細胞中豐富表達的非編碼RNA[4-5]，在炎癥和免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[6-7]。目前公認的miR-21靶基因包括磷酸酶及張力蛋白同源缺失性基因、凋亡相關(guān)蛋白4抗原等[8]。近年來，對miR-21與信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3相互作用的研究越來越多。在膠質(zhì)母細胞瘤中，miR-21以STAT3依賴方式下調(diào)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達，從而抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞生長[9]。STAT通路上游是酪氨酸激酶家族蛋白，能夠整合來自不同通路的信號，其中STAT3、STAT5具有共同的結(jié)構(gòu)基序，可以被多種細胞因子和生長因子活化，持續(xù)的STAT3/STAT5活化可促進慢性炎癥，提高健康細胞的致癌敏感性，因而在炎癥與癌癥的研究中逐漸受到重視[10]。Dong等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中miR-21的表達水平下降，并伴有STAT3表達及活化增加，STAT5及其磷酸化蛋白、調(diào)節(jié)性T細胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子叉頭轉(zhuǎn)錄因子3的表達減少，提示miR-21可能通過STAT3/STAT5調(diào)控T細胞的分化與自穩(wěn)，參與類風濕關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。本研究使用miR-21過表達及抑制的慢病毒顆粒感染細胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的THP-1細胞系，對miR-21在炎癥反應(yīng)中的作用進行深入研究，以期為miR-21的生物學特性及其在免疫細胞調(diào)控中作用的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 THP-1細胞株為江蘇大學中心實驗室保存；LV-miR-21、LV-miR-21 Sponge、LV-GFP-Puro慢病毒顆粒(上海吉瑪制藥有限公司，批號：20180203；20180330；20180129)；All-in-OneTMmiRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測試劑盒；Lipofectamine 2000(美國Thermo公司，批號：11668-500)；嘌呤霉素(美國Target Mol公司，批號：ITM10036649)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：Sa00001-2)、兔抗人STAT3(美國Cell Signaling Technology公司，批號：Ba0621)、STAT5抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號：Ba1411)。

1.2方法

1.2.1LV-miR-21、LV-miR-21 Sponge、LV-GFP-Puro 慢病毒顆粒感染THP-1細胞 使用96孔板測定感染復(fù)數(shù)值為10、50、100、200時THP-1細胞的轉(zhuǎn)染效率。當感染復(fù)數(shù)值為100時，觀察THP-1細胞轉(zhuǎn)染效率最高，且未見細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變。感染前1天對THP-1細胞進行計數(shù)，按照2×104個/孔接種于96孔板。24 h后細胞融合率為50%～70%，棄去細胞培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖溶液洗滌1次，向6孔板中加入聚凝胺溶液5 mg/L預(yù)刺激30 min；取病毒上清加入相應(yīng)THP-1細胞的96孔板中(感染復(fù)數(shù)為100)，4 h后定容至100 μL，感染8～12 h后更換正常RPMI-1640完全培養(yǎng)基；72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿中的細胞，鏡下隨機選取視野，分別于明暗視野觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況，計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞株 病毒感染48 h后，將培養(yǎng)液更換為含2 mg/L嘌呤霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進行抗性篩選，同時以未感染病毒的THP-1細胞作為陰性對照。培養(yǎng)2 d后，陰性對照組細胞全部死亡，病毒感染組細胞正常生長。根據(jù)轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒的不同將轉(zhuǎn)染后的THP-1細胞分為對照組(轉(zhuǎn)染LV-GFP-Puro慢病毒顆粒)、LV-miR-21組(轉(zhuǎn)染LV-miR-21慢病毒顆粒，過表達miR-21)和miR-21 Sponge組(轉(zhuǎn)染LV-miR-21 Sponge慢病毒顆粒，抑制miR-21表達)。

1.2.3miR-21靶基因STAT3的生物信息學分析 使用miRNA靶基因預(yù)測軟件miRanda database(http://www.mirbase.org/)對人miR-21進行靶基因預(yù)測。

1.2.4檢測THP-1細胞中miR-21、STAT3、STAT5信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表達 采用實時熒光定量PCR檢測THP-1細胞中miR-21、STAT3、STAT5 mRNA的表達。收集6孔板細胞，使用Trizol RNA分離試劑(美國Sigma-Aldrich公司，批號：BCBV9270)提取細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA。引物：miR-21(cat.no.HmiRQP0316)以U6(cat.no.HmiRQP9001)為內(nèi)參基因；STAT3(cat.no.HQP017767)、STAT5a(cat.no.HQP017771)、STAT5b(cat.no.HQP017774)以人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(cat.no.HQP006940)為內(nèi)參基因。使用All-in-OneTMmiRNA實時熒光定量PCR檢測試劑盒進行上機檢測。反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性10 min，1個循環(huán)；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，操作嚴格按照試劑說明書進行，設(shè)置3個復(fù)孔，使用2-ΔΔCT法計算RNA的相對表達量。

1.2.5檢測THP-1細胞中STAT3、STAT5的表達 采用蛋白電泳法檢測THP-1細胞中STAT3、STAT5的表達。將各組THP-1細胞以180×g，離心5 min，去掉培養(yǎng)基后，使用1 mL磷酸鹽緩沖溶液洗滌2～3次；用細胞及組織蛋白裂解液、磷酸蛋白酶抑制劑、苯甲基磺酰氟配置裂解液，提取細胞蛋白。將總蛋白煮沸10 min使其變性；取適量蛋白樣品進行電泳，并電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃條件下孵育約16 h，洗滌液洗膜3次后，分別加入辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G二抗(羊抗兔1∶1 000)，室溫孵育1 h，洗滌液洗膜5次，加入曝光液暗室孵育約30 s，利用Tanon5200超靈敏化學發(fā)光成像儀(上海天能科技有限公司，型號：Tanon5200)進行顯色，采用LAND-1軟件進行灰度掃描。

2 結(jié) 果

2.1三組慢病毒顆粒的轉(zhuǎn)染情況 倒置熒光顯微鏡下，綠色熒光蛋白表達陽性細胞呈懸浮狀態(tài)，LV-miR-21 組、miR-21 Sponge組及對照組THP-1細胞的轉(zhuǎn)染率達90%以上，表明病毒顆?？稍赥HP-1細胞中表達蛋白，見圖1。

2.2三組感染慢病毒顆粒THP-1細胞中miR-21的表達水平比較 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，三組miR-21的表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，LV-miR-21組miR-21表達水平高于對照組，miR-21 Sponge組的miR-21表達水平低于LV-miR-21組，見表1。

表1 三組感染慢病毒顆粒THP-1細胞中miR-21的表達水平比較

2.3miR-21靶基因STAT3預(yù)測結(jié)果 采用miRanda database在線理論預(yù)測軟件進行分析發(fā)現(xiàn)，理論上STAT3基因的3′非翻譯區(qū)與miR-21存在7個堿基互補區(qū)，見圖2。

STAT：信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子；3′UTR:3′非翻譯區(qū)；miRNA：微RNA

2.4三組感染慢病毒顆粒THP-1細胞中STAT3、STAT5 mRNA的表達 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，三組STAT3比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，LV-miR-21組THP-1細胞中STAT3 mRNA的表達水平低于對照組，miR-21 Sponge組STAT3 mRNA表達水平高于對照組和LV-miR-21組(P<0.05)；三組STAT5a、STAT5b mRNA的表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組感染慢病毒顆粒THP-1細胞中STAT3、STAT5 mRNA的表達水平比較

2.5三組感染慢病毒顆粒THP-1細胞中STAT3、STAT5蛋白表達的比較 使用LAND-1軟件對蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果進行灰度掃描顯示，與對照組相比，LV-miR-21組THP-1細胞中STAT3蛋白表達下調(diào)，STAT5蛋白表達上調(diào)；而miR-21 Sponge組THP-1細胞中STAT3蛋白表達上調(diào)，STAT5蛋白表達下調(diào)，見圖3。

STAT：信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子；miRNA：微RNA；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Fold:灰度值

3 討 論

miR-21是一種重要的致癌小RNA分子，在多種腫瘤患者血清中高表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫反應(yīng)調(diào)控密切相關(guān)[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在多種炎癥及自身免疫反應(yīng)中表達異常，可調(diào)節(jié)多種免疫細胞的分化、增殖及活化。已有研究表明，miR-21通過下調(diào)樹突狀細胞中白細胞介素(interleukin，IL)-35的表達影響輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)1/Th2細胞平衡[15]，通過下調(diào)Smad7(T細胞中Th17細胞分化的負調(diào)控因子)的表達，促進Th17細胞的分化[16]。STAT3和STAT5是STATs家族的重要成員，STAT5存在兩種異構(gòu)體即STAT5a和STAT5b，兩者有94%的同源性，STAT5a主要表達于哺乳動物腺體，STAT5b主要表達于肌肉和肝臟[17]，但STAT3、STAT5a、STAT5b可以被IL-6、胰島素樣生長因子、集落刺激因子-1等活化，參與多種疾病的炎癥反應(yīng)[18-20]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過STAT3/STAT5調(diào)控類風濕關(guān)節(jié)炎患者Th17/調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg細胞)的失衡[11]。為了進一步研究免疫細胞中miR-21的生物學功能，本研究使用miR-21過表達及抑制慢病毒顆粒感染，經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得能夠穩(wěn)定過表達或抑miR-21的THP-1細胞。

本研究中，與對照組比較，miR-21 Sponge組中miR-21的表達水平未見明顯改變，而STAT3 mRNA的表達水平升高。研究顯示，慢病毒感染THP-1細胞較其他穩(wěn)轉(zhuǎn)方法的效率更高[21]，故本研究選用慢病毒顆粒構(gòu)建miR-21過表達及抑制的THP-1細胞系。倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達水平，并采用實時熒光定量PCR檢測miR-21對模型進行驗證。miRanda在線預(yù)測軟件提示，miR-21與STAT3之間可能存在靶向關(guān)系，鑒于STAT5與STAT3同屬于STAT家族，具有共同的結(jié)構(gòu)基序，可以被相同的細胞因子或生長因子激活，參與信號轉(zhuǎn)錄及多種疾病的炎癥反應(yīng)[10]，故可檢測THP-1細胞中STAT3、STAT5的表達水平。Zhou等[22]的研究顯示，miR-21-5p轉(zhuǎn)染CD4+T細胞后能夠直接靶向STAT3，介導T細胞亞群失衡。本研究中，THP-1細胞感染LV-miR-21及miR-21 Sponge后，STAT5a、STAT5b mRNA表達水平無明顯差異，然而，蛋白電泳顯示LV-miR-21組STAT5表達增多，miR-21 Sponge組STAT5表達降低，提示miR-21可影響轉(zhuǎn)錄后STAT5水平的表達。與前期對類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血研究中，miR-21低表達并伴STAT3表達及活化增加以及STAT5及其磷酸化蛋白表達減少一致[11]。

有關(guān)STAT3、STAT5的早期研究主要集中在對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[23]。研究表明，STAT3、STAT5對Th17細胞和Treg細胞的分化至關(guān)重要。在轉(zhuǎn)化生長因子-β和IL-6的存在下，STAT3能夠激活Th17細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子視黃酸相關(guān)孤獨核受體γt，進而參與Th17細胞分化[24]，Th17細胞通過分泌IL-17A及相關(guān)細胞因子發(fā)揮促炎作用[25]。此外，STAT3信號通路激活后亦能夠促使叉頭轉(zhuǎn)錄因子3基因增強子中的重要結(jié)構(gòu)CpG島發(fā)生甲基化，從而抑制RNA水平上叉頭轉(zhuǎn)錄因子3的表達以及Treg細胞的分化[26]。一方面，STAT5是調(diào)控Treg細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭轉(zhuǎn)錄因子3表達的關(guān)鍵因子，在IL-2、轉(zhuǎn)化生長因子-β及抗原信號存在的條件下促進原始CD4+T細胞向Treg細胞分化；另一方面，STAT5能夠與STAT3競爭IL-17基因結(jié)合位點，抑制Th17細胞的分化[27]。Treg細胞通過細胞接觸、分泌IL-35、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β等抑制性細胞因子方式抑制靶細胞代謝等，在維持機體免疫耐受、炎癥、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要的作用[28-29]。Th17細胞和Treg細胞在分化過程中相互關(guān)聯(lián)，在功能上卻相互拮抗。STAT3、STAT5對免疫系統(tǒng)的影響主要是通過影響Th17和Treg細胞的分化以及制約Th17與Treg細胞之間的平衡而實現(xiàn)的，在類風濕關(guān)節(jié)炎、兒童過敏性紫癜等疾病的治療中具有重要意義[30]。miR-21可能通過調(diào)控STAT3、STAT5參與炎癥中免疫反應(yīng)，但其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定過表達和抑制miR-21的THP-1細胞系，為進一步研究miR-21的生物學特性及其在免疫細胞調(diào)控中的作用奠定了基礎(chǔ)。在THP-1細胞中的miR-21可在RNA和蛋白水平抑制STAT3的表達，并正向調(diào)節(jié)STAT5蛋白的表達。