連文靜，賀小瓊，趙 慶，王宜挺，吳 怡，尤雨桐

（1） 昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,云南昆明 650500；2） 蘇州藥明康德新藥開發(fā)有限公司,江蘇蘇州 215104；3） 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500；4） 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，云南昆明 650201；5） 昆明醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，云南昆明 650500）

松蘿屬于地衣門，松蘿科植物，近幾年松蘿的藥用價(jià)值引起了藥物化學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注[1-3]，松蘿胺[C18H17NO6,6-乙?；?2-（1-氨基-亞乙基）-7,9-二羥基-8,9b-二甲基-9bH-二苯呋喃-1,3-二酮]是從松蘿中提取的天然抗腫瘤活性物質(zhì)，初步試驗(yàn)結(jié)果證明對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、人鼻咽癌細(xì)胞等有較強(qiáng)的體外抗癌活性[4-5]。

從植物中尋找分離活性化合物的方法效率低、時(shí)間長(zhǎng)，而對(duì)天然活性先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可解決植物資源短，分離困難的難題，同時(shí)也是改善活性化合物毒性，減少毒副作用的高效方法[6]。經(jīng)過對(duì)先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)修飾改造，合成具有抗癌抗菌活性的新型結(jié)構(gòu)衍生物一直是科研工作者們研究的熱點(diǎn)。

本次實(shí)驗(yàn)受姜黃素?zé)熕狨7]及香豆素?zé)熕狨8]合成的啟發(fā)，選用具有促進(jìn)代謝，調(diào)節(jié)血脂同時(shí)又可以作為藥物合成中間體[9-12]的煙酸作為?；瘎滦透咝A性親核催化劑4-二甲氨基吡啶（4-Dimethylaminopyridine，DMAP） 作為催化劑，以 N,N'-二異丙基碳二酰亞胺 （N,Napos;-Diisopropylcarbodiimide，DIC） 作為脫水劑，通過酰化反應(yīng)將煙酸連接到松蘿胺分子結(jié)構(gòu)中制備有抗癌活性的衍生物，以期得到性狀優(yōu)良的結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物，豐富抗癌候選藥物種類。

1 材料與方法

1.1 人癌細(xì)胞株

人鼻咽癌細(xì)胞（CNE2）、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U-251）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116） 均由云南省腫瘤醫(yī)院提供。

1.2 藥物試劑與儀器

松蘿胺（C18H17NO6） 由實(shí)驗(yàn)室合成，經(jīng)HPLC 鑒定，其純度大于99.8%。4-二甲氨基吡啶（DMAP） （九鼎化學(xué)科技有限公司），N，N-二異丙基碳二亞胺（DIC）、煙酸、二氯甲烷（分析純，均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司）。注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：8C0174B02）胰蛋白酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（均購(gòu)自HyClone 公司）。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000B（上海亞榮生化儀器廠），循環(huán)水真空泵SHZ-D(Ⅲ)（上海力辰邦西儀器科技有限公司），超聲波清洗機(jī)SB-5200DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司），Thermo Forma SeriesⅡ二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma 公司），高效液相色譜儀L-2000（日本日立公司），紫外可見分光光度計(jì)U-3010（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 合成設(shè)計(jì)及原理 稱取松蘿胺343 mg，置于旋蒸瓶中，室溫下加入約100 mL 的二氯甲烷溶劑，超聲10 min 使松蘿胺完全溶解。稱量約246 mg 煙酸和約15 mg DMAP 加入旋蒸瓶中，邊攪拌邊加入約1 mL DIC，然后用錫箔紙密封，靜置反應(yīng)，每隔1 h 取樣，用TLC 檢測(cè)反應(yīng)情況，當(dāng)有反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)且不再變化時(shí)，停止反應(yīng)。加入約3 mL 蒸餾水?dāng)嚢杓s20 min，然后將反應(yīng)溶劑蒸干，拌樣上300～400 目硅膠柱，用石油醚：乙酸乙酯（3:1～1:1） 梯度洗脫，得到化合物N。合成設(shè)計(jì)線路見圖1。

圖1 合成設(shè)計(jì)線路Fig.1 Synthetic routes of compounds

1.3.2 體外抗腫瘤活性研究 采用MTT 法[13-15]，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于96 孔板中，濃度為6 000 個(gè)/孔，順鉑作為陽性藥物。24 h 后，棄去培養(yǎng)液加入含有不同藥物濃度的完全培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，加入200 μL 含有10%MTT 的完全培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄去培養(yǎng)液，加入150 μL 二甲基亞砜，避光震搖10 min 后，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)吸光度（A），檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm，計(jì)算對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。

實(shí)驗(yàn)分組：（1） 空白對(duì)照組：不接種癌細(xì)胞，其他處理同實(shí)驗(yàn)組；（2） 溶劑對(duì)照組：每1 mL 培養(yǎng)液中加入1 μL DMSO；（3） 陽性對(duì)照組：用PBS 將順鉑配制成2 μg/mL；（4） 藥物處理組：松蘿煙酰胺組濃度為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μmol/L，松蘿胺組濃度為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μmol/L。

1.3.3 在不同溶劑中的溶解度測(cè)試[18-19]取適量的化合物N 用色譜甲醇稀釋至適量濃度，用紫外分光光度計(jì)做全波長(zhǎng)掃描，確定其最大吸光波長(zhǎng)223 nm，配制濃度為2、4、6、8、10 μg/mL 松蘿煙酰胺和松蘿胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，取3 mL 置于紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)，記錄吸光度，以檢測(cè)藥物濃度（X,μg/mL） 為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)（Y） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

松蘿煙酰胺在甲醇、無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇及正辛醇溶劑中的吸光度回歸方程分別為：Y=0.109X-0.080 4，R2=0.998 4；Y=0.078 3X-0.028 9，R2=0.9988；Y=0.083 9X-2E-05，R2=0.999 6；Y=0.096 4X-0.007 4，R2=0.999 4；Y=0.071 4X-0.004 3，R2=0.999 1。

松蘿胺在甲醇、無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇及正辛醇溶劑中的吸光度回歸方程分別為：Y=0.098X-0.022 3，R2=0.999 6；Y=0.088 6X-0.076 5，R2=0.998 6；Y=0.121X-0.056 7，R2=0.999 3；Y=0.095 7X-0.016，R2=0.999 8；Y=0.100 3X+0.027 6，R2=0.998 5。

帶塞三角燒瓶中分別倒入約20 mL 甲醇、無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇及正辛醇，分別加入過量的松蘿胺和化合物N，每個(gè)樣品平行三份。置于恒溫?fù)u床上震搖24 h，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取3 mL 置于紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣本數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化合物N 的波譜數(shù)據(jù)

化合物N 為淡黃色粉末，收率31.8%；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ12.12 (s,1H),11.97 (s,1H),9.40(s,1H),8.90(d,J=4.3 Hz,1H),8.56 (d,J=8.0 Hz,1H),7.59(dd,J=7.9,5.1 Hz,1H),7.06(d,J=15.1 Hz,1H),5.78 (s,1H),2.60 (s,3H),2.46 (s,3H),2.09(s,4H),1.73(s,4H)。

13C NMR(126 MHz,CDC13)δ197.96(C),194.17(C),190.20(C),175.41(C),173.64(C),163.91(C),156.25(C),155.31(C),152.59(CH),150.33(CH),148.83(C),139.13(CH),126.10(C),124.16(CH),116.42(C),113.15(C),108.65(C),102.79(CH),101.57(C),56.89(C),32.61(CH3),31.69(CH3),26.07(CH3),8.83(CH3)。

經(jīng)專家鑒定得到化合物E） -N-(1-(6-乙?；?7,9-二羥基-8,9b-二甲基-1,3-二氧代-3,9b-二氫二苯并[b，d]呋喃-2(1-H)-亞烷基)乙基)異煙酰胺，分子式為C24H20N2O7，分子量448；中文名為煙酰松蘿胺，結(jié)構(gòu)式見圖2。

2.2 體外抗腫瘤活性測(cè)試

與陰性對(duì)照組相比，新化合物松蘿煙酰胺在不同濃度下對(duì)CNE2、U251、HCT-116 腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制，IC50 分別為（1.68±0.51）、（2.14±0.41）、（1.93±0.13） μmol/L。在三種測(cè)試細(xì)胞株中，對(duì)HCT-116 細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。相同條件下松蘿胺對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的IC50 分別為（1.53±0.14）、（1.48±0.3）、（1.40±0.07）μmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

2.3 溶解度測(cè)試

松蘿胺經(jīng)?；磻?yīng)后得到的化合物松蘿煙酰胺在正辛醇溶劑及75%乙醇溶劑中的溶解度提升，在甲醇及無水乙醇溶劑中的飽和溶解度下降，見表3。

圖2 化合物N 的結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure diagram of compound N

表1 松蘿煙酰胺對(duì)CNE2、U251、HCT-116 細(xì)胞作用72 h 的抑制率［（±s），n=3］Tab.1 Inhibition rate of usnea nicotinyl amine on CNE2,U251 and HCT-116 cells for 72 h［（±s），n=3］

表1 松蘿煙酰胺對(duì)CNE2、U251、HCT-116 細(xì)胞作用72 h 的抑制率［（±s），n=3］Tab.1 Inhibition rate of usnea nicotinyl amine on CNE2,U251 and HCT-116 cells for 72 h［（±s），n=3］

與溶劑對(duì)照組比較，**P ＜0.01。

表2 松蘿胺對(duì)CNE2、U251、HCT-116 細(xì)胞作用72 h 的抑制率［（±s），n=3］Tab.2 Inhibition rate of usenamine on CNE2,U251 and HCT-116 cells for 72h［（±s），n=3］

表2 松蘿胺對(duì)CNE2、U251、HCT-116 細(xì)胞作用72 h 的抑制率［（±s），n=3］Tab.2 Inhibition rate of usenamine on CNE2,U251 and HCT-116 cells for 72h［（±s），n=3］

與溶劑對(duì)照組比較，**P ＜0.01。

表3 在不同溶劑中的飽和溶解度測(cè)試結(jié)果［（±s），n=3］Tab.3 Saturated solubility test results of two compounds in different solvents［（±s），n=3］

表3 在不同溶劑中的飽和溶解度測(cè)試結(jié)果［（±s），n=3］Tab.3 Saturated solubility test results of two compounds in different solvents［（±s），n=3］

與松蘿胺比較，**P ＜0.01。

3 討論

長(zhǎng)松蘿有抗炎、抗菌、抗氧化、抗輻射等作用，具有清熱解毒、祛濕止痛、祛痰止咳、清肺熱等功效[2，20-22]，同時(shí)也是蒙藥的常用藥材[23]，松蘿胺作為長(zhǎng)松蘿的抗腫瘤活性成分被發(fā)現(xiàn)，本課題組近年來一直致力于松蘿胺的研究，本次實(shí)驗(yàn)是首次對(duì)松蘿胺的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，通過?；磻?yīng)將煙酸連接到松蘿胺的氨基中，得到一個(gè)未見報(bào)道的化合物松蘿煙酰胺。經(jīng)過體外活性測(cè)試，結(jié)構(gòu)修飾物松蘿煙酰胺具有抗腫瘤活性，對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用。說明松蘿胺的氨基可作為結(jié)構(gòu)修飾的位點(diǎn)連接基團(tuán)，其產(chǎn)物松蘿煙酰胺仍具有抗癌活性，且在含水乙醇和正辛醇溶劑中的飽和溶解度提高。

在本次實(shí)驗(yàn)中采用高效催化劑DMAP，其催化效果顯著優(yōu)于無水吡啶，且用量少；DIC 作為脫水劑在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少，容易水解去除。整個(gè)合成線路簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，后處理及操作簡(jiǎn)單且容易控制，對(duì)松蘿胺結(jié)構(gòu)修飾及優(yōu)良抗癌活性化合物的發(fā)現(xiàn)具有重要的參考意義。