廖 婧，許長(zhǎng)俊，周紅林，劉 洋

（1） 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，云南昆明 650101；2） 玉溪市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南玉溪 653100；3） 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南昆明 650101）

宮頸癌（cervical cancer，CC） 是發(fā)展中國(guó)家婦女患病率最高的生殖道惡性腫瘤，我國(guó)每年新增確診人數(shù)超過13 萬(wàn)，為全球患病人數(shù)的28.2%[1]。大樣本數(shù)據(jù)證實(shí)，幾乎所有CC 和絕大多數(shù)宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN） 患者中均可發(fā)現(xiàn)HPV 感染[2]，高危型HPV 持續(xù)感染者首先出現(xiàn)CIN，其需要10 a 及以上演變至CC，因此國(guó)內(nèi)外專家一致認(rèn)為高危型HPV 的持續(xù)感染是CC 及CIN 的高危因素。目前HC2 HPV檢測(cè)法是被世衛(wèi)組織公認(rèn)的可用于臨床的HPV 檢測(cè)技術(shù)，其已被推廣使用于世界各國(guó)。但由于CC及CIN 的發(fā)病率遠(yuǎn)低于HPV 的高感染率（70%～80%）[3]，提示除HPV 感染外還有其他因素影響CC 的發(fā)生和進(jìn)展，如基因的調(diào)控[4]等。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，c-Myc 基因是位于染色體8q34 上的一個(gè)癌基因，其在細(xì)胞增值、分化和凋亡等發(fā)揮至關(guān)重要的作用。已證實(shí)該基因的過度擴(kuò)增與乳癌、膽囊癌、胃腸道腫瘤等多種實(shí)體惡性腫瘤的發(fā)展預(yù)后息息相關(guān)，其可能也是宮頸癌的一種潛在標(biāo)志物[5]。而hTERT 做為端粒酶的催化劑，其通過決定端粒酶活性以影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，hTERT 的高表達(dá)與90%惡性腫瘤均有密切聯(lián)系[6]，其中也包括宮頸癌。本研究以組織病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用FISH 技術(shù)和雜交捕獲技術(shù)分別檢測(cè)不同宮頸組織中c-Myc 基因、hTERT 基因與HPV 等生物標(biāo)志物，旨在探究其與CC 發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性，以及c-Myc 基因、hTERT 基因?qū)Y檢CC 的應(yīng)用價(jià)值，為CC 的防治提供更全面高效的臨床思路和篩查策略。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象為1 200 名于昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦科就診且行宮頸篩查的患者，入選條件為有性生活且已排除妊娠可能、既往未行陰道鏡檢查、宮頸活檢及宮頸局部治療等，分別行HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 檢測(cè)，任意一項(xiàng)結(jié)果異常者（150例） 行宮頸活檢術(shù)，以組織病理學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，其中正常組32 例，CIN 組104 例（包括CINI38 例，CINII/CINIII66 例），CC 組14 例。本研究已通過醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審查。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集及實(shí)驗(yàn)步驟 取得患者知情同意后，借助陰窺器顯露宮頸，于宮頸鱗-柱交界區(qū)域用指定的樣本采集刷旋轉(zhuǎn)3～5 圈，后置于保存液內(nèi)，標(biāo)記后送檢。HC2 技術(shù)依照相關(guān)試劑盒操作指南完成。FISH 技術(shù)亦嚴(yán)格遵照FISH 探針（由北京金菩嘉提供） 操作指南進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 選擇符合條件的100 個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，即具有完整的細(xì)胞核形態(tài)且強(qiáng)雜交信號(hào)。被特異性探針標(biāo)記者表現(xiàn)為紅色、綠色熒光。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):c-Myc 基因：細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)多于2 個(gè)特定熒光標(biāo)記者為異常細(xì)胞。若異常細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)≥指定數(shù)值，則代表c-Myc 基因陽(yáng)性，其擴(kuò)增異常。hTERT 基因的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)同前。HC2-HPV 的結(jié)果判讀：≥1.0 pg/mL（≥5 000 copies/mL） 為陽(yáng)性，＜1.0 pg/mL 則為陰性[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS 分析，通過繪制受試者工作曲線（receiver operator characteristic curves，ROC） 來分析c-Myc 基因、hTERC 基因及HC2-HPV 分子檢測(cè)單獨(dú)檢測(cè)宮頸癌前病變的效能。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)和Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HC2 -HPV、c-Myc 基因、hTERT 基因檢測(cè)結(jié)果與病理學(xué)診斷結(jié)果對(duì)比

因HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因檢測(cè)中任意一項(xiàng)結(jié)果有異者行陰道鏡下活檢，共150 例，其中正常組32 例，CIN I 38 例，CIN II/CIN III 66例，CC 組14 例。對(duì)上述病理學(xué)結(jié)果與其HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變的加重，HC2-HPV 感染率、c-Myc 和hTERT 基因表達(dá)率均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 宮頸病變與HC2 -HPV 感染、c-Myc 及hTERT 基因表達(dá)的相關(guān)性分析［n（%）］Tab.1 Correlation analysis of cervical lesions with HC2 -HPV infection,c-myc and hTERT gene expression［n（%）］

2.2 HC2 -HPV、c-Myc 和hTERT 基因篩檢宮頸病變的ROC 曲線分析

HC2－HPV 法單獨(dú)預(yù)測(cè)宮頸病變的AUC 為0.699（95%CI:0.613～0.785，P=0.000），靈敏度為91.3%，特異度為48.6%。c-Myc 基因檢測(cè)法單獨(dú)篩檢宮頸病變的AUC 為0.677（95%CI:0.59～0.763，P=0.000），靈敏度為62.5%，特異度為72.9%。hTERT 基因檢測(cè)法單獨(dú)篩檢宮頸病變的AUC 為0.687（95%CI:0.601～0.772，P=0.000），靈敏度為58.8%，特異度為78.6%，見圖1。

2.3 c-Myc 基因、hTERT 基因表達(dá)與HC2-HPV感染在宮頸病變中的關(guān)系

隨著宮頸病變程度的升級(jí)，c-Myc 基因和hTERT 基因的擴(kuò)增表達(dá)率和HC2-HPV 感染率均有不同程度的上升，且c-Myc 和hTERT 兩種基因的表達(dá)與HC2-HPV 感染率之間呈正相關(guān)（r1=0.576，P=0.000；r2=0.545，P=0.000），見表2。

圖1 HC2 -HPV、c-Myc 和hTERT 基因單獨(dú)篩檢宮頸病變的ROC 曲線圖Fig.1 ROC curves of HC2-HPV,C-MYC and hTERT genes for screening cervical lesions separately

表2 HC2-HPV 陽(yáng)性、c-Myc 基因陽(yáng)性及hTERT 基因陽(yáng)性之間的相關(guān)性分析［n（%）］Tab.2 The correlation between the positive result of HC2-HPV,C-MYC and hTERT［n（%）］

3 討論

CC 的發(fā)病人群日益年輕化，但疾病發(fā)展卻十分緩慢，從最初的CIN 發(fā)展至CC 約10～20a，因此早期、及時(shí)的診斷和治療顯得尤其重要[8]，現(xiàn)可明確高危型HPV 感染系導(dǎo)致宮頸病變的首要因素，因此及時(shí)檢測(cè)HPV 對(duì)于防治CC 具有重要意義。HC2 檢測(cè)技術(shù)是最早被美國(guó)、歐洲和中國(guó)等多個(gè)國(guó)家認(rèn)可并被建議作為HPV 檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，因?yàn)槠淇稍诜肿铀綄?duì)13 種高危型HPV 進(jìn)行HPV-DNA 定性測(cè)量（≥1.0 ng/L 即為陽(yáng)性）。本研究結(jié)果顯示，與基因檢測(cè)對(duì)比，HC2 技術(shù)檢測(cè)HPV 感染對(duì)評(píng)估宮頸病變具有較高的靈敏度（91.3%），可顯著降低CIN 及CC 漏診率，這與Yin[10]的文章數(shù)據(jù)相一致，但特異度較低，存在一定的誤診幾率，不可避免會(huì)增加患者的心理焦慮及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此僅憑HC2-HPV 陽(yáng)性無(wú)法準(zhǔn)確判斷和評(píng)估宮頸病變的嚴(yán)重程度，其在臨床中篩查宮頸病變并不全面，需要新的生物標(biāo)志物來協(xié)同判斷和評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度。

c-Myc 基因作為癌基因家族的成員之一，因其通過調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡使惡性腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖，被證實(shí)與前列腺癌、胃癌、肝癌等多種實(shí)體惡性腫瘤的發(fā)生有極強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。近年來多位婦瘤專家與學(xué)者也已證實(shí)[11]，c-Myc 基因過度表達(dá)的患者發(fā)生CC 及CIN 的可能性較高，c-Myc 基因或許可成為CC 的特異性診斷指標(biāo)。本研究數(shù)據(jù)示，CC 和CIN 組中c-Myc 基因表達(dá)擴(kuò)增率顯著高于正常組，提示c-Myc 在CC 和CIN 中過度表達(dá)，這與盧建軍[12]的結(jié)論相一致?；诨驒z測(cè)技術(shù)水平，C-myc 基因的特異度較高，且其與高危型HPV 感染情況密切相關(guān)，提示c-Myc 基因檢測(cè)可以與HC2 法聯(lián)合作為宮頸病變嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。

hTERT 基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)記物，研究提示它的擴(kuò)增率會(huì)隨著宮頸病變級(jí)別的增高而增加[13]。作為端粒酶的催化亞基，它的擴(kuò)增表達(dá)情況可影響染色體端粒的長(zhǎng)度以使細(xì)胞永生化，使腫瘤細(xì)胞獲得無(wú)限生長(zhǎng)進(jìn)化的優(yōu)勢(shì)[14]，其對(duì)包括CC 在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展十分關(guān)鍵。本研究表明，hTERT 基因在宮頸正常組、CINI 組、CIN II-III 組、CC 組中的表達(dá)率分別為12.50%、34.21%、53.03%、85.71% （χ2=28.9，P=0.000）。提示hTERT 基因擴(kuò)增表達(dá)率隨宮頸病變的升級(jí)而升高，且正常組與CINI 組明顯低于CIN II-III 組與CC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與陳露露等人[15]結(jié)論相似。與常用的HC2-HPV 法相比，通過FISH 技術(shù)測(cè)定hTERT 基因具有特異性高、準(zhǔn)確性較好的優(yōu)點(diǎn)，單獨(dú)檢測(cè)該基因?qū)m頸癌診斷有一定的價(jià)值，但是聯(lián)合其他標(biāo)志物（如HPV、c-Myc 基因等） 檢測(cè)將更有意義，能提高CC 及CIN 診斷的敏銳性和準(zhǔn)確性[16]。

綜上所述，本文論述了HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因檢查在篩檢宮頸病變中的應(yīng)用價(jià)值，條件允許者建議聯(lián)合篩查，可顯著提升宮頸疾病診斷的靈敏性和特異性，具有可觀的診斷應(yīng)用前景。不僅如此，基于對(duì)上述兩種基因的深入探究和摸索，現(xiàn)已有相關(guān)基因靶向藥物或酶抑制劑[17-18]處于研發(fā)試驗(yàn)階段。相信隨著醫(yī)學(xué)科技不斷進(jìn)步和發(fā)展，c-Myc 和hTERT 基因在宮頸癌的診治方面會(huì)有更大的利用價(jià)值。