梁蔚蔚，李曉波，李 燕，劉 華，武俊紫

（云南省第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，云南昆明 650032）

近年來(lái)我國(guó)人民的生活水平日益提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生明顯改變，肥胖、脂肪肝、2型糖尿病、代謝綜合征等患者逐年增多。其中，非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的肝病，10 a 前即有報(bào)道NAFLD 與糖尿病、心血管疾病等密切相關(guān)[1-2]，日益受到廣泛重視。NAFLD 是指除外過(guò)量飲酒和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積。NAFLD 病變主體在肝小葉，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性和脂肪貯積為病理特征的臨床病理綜合征。包括從單純的肝脂肪變性（simple nonalcoholic fattyliver，NAFL） 到非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis，NASH），以致一部分最終發(fā)展為肝硬化（Cirrhosis），甚至演變?yōu)楦渭?xì)胞性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）。目前，NAFLD 在全球及亞洲人群患病率約為25%[3-4]，我國(guó)的患病率為6%～27%[5]。然而，目前尚無(wú)確切治療NAFLD 的藥物，對(duì)NAFLD 治療有效的藥物是有限的。研究顯示，維生素E 和胰島素增敏劑噻唑烷二酮TZDs 吡格列酮可以改善NAFLD 肝酶水平及肝臟組織學(xué)表現(xiàn)，但兩種藥物均缺乏長(zhǎng)期療效和安全性[6-7]。國(guó)內(nèi)研究顯示，黃連素可治療伴糖代謝異常的NAFLD 患者，降低肝臟脂肪含量，增加胰島素敏感性，隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)尚在進(jìn)行中[8]。

體重減少3%～5%可能會(huì)改善肝臟脂肪變性，但減少肝臟炎癥需要更顯著的體重下降（5%～10%體重）[6，9-10]。目前治療NAFLD 最安全、有效的方法是改變生活方式、降低體重[11]，然而有效率僅50%[9]。艾塞那肽作為GLP-1 的一種受體動(dòng)劑，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有顯著的減肥作用，能控制食欲、減少食物吸收，同時(shí)調(diào)節(jié)脂肪代謝，降低血糖而不引起低血糖反應(yīng)[12-13]。本研究觀察艾塞那肽治療后NAFLD 大鼠肝臟病理、胰島素抵抗、SREBP-1、ACCα 以及SCD1 表達(dá)的改變，探討艾塞那肽對(duì)NAFLD 大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供150 只實(shí)驗(yàn)用 SD 大鼠[（合格證號(hào):SYXK （Yunnan）2011-0004]，每只大鼠體重約為180～200 g。

1.2 動(dòng)物模型的建立及分組給藥

1.2.1 NAFLD 大鼠的模型建立 NAFLD 大鼠造模使用的灌胃100%高脂溶液的配方為：97%豬油（市場(chǎng)自購(gòu)）、2%膽固醇、及1%膽酸鈉。大鼠灌胃量為每100 g 大鼠體重予1 g 高脂溶液。每天早上7:00-9:00 灌胃，持續(xù)12 周。高脂飲食灌胃12 周后，HE 染色顯示肝臟組織脂肪變性及血清肝功能的改變是評(píng)價(jià)大鼠造模成功的重要因子[14-15]。

1.2.2 分組和給藥劑量 SD 大鼠灌胃造模成功后，100 只隨機(jī)分為模型對(duì)照組（HFD）、艾塞那肽低劑量（ELD）、中劑量（EMD）、高劑量（EHD） 干預(yù)組，每天分別予艾塞那肽1 μg、2 μg、4 μg/kg（大鼠體重） 注射，多烯磷脂酰膽堿治療組（PDC） 每天予PDC 46 mg/kg（大鼠體重） 注射。NAFLD 模型組及空白組（CON） 予普通生理鹽水注射，以上各組均在大鼠頸部皮下注射。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 艾塞那肽購(gòu)自Baxter Pharmaceutical Solutions LLC，多烯磷脂酰膽堿購(gòu)自賽諾菲安萬(wàn)特制藥有限公司，瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 生物公司；胰島素試劑盒購(gòu)自Bio-Swamp 公司，血糖試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；總RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根公司，多克隆抗體試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，相應(yīng)二抗購(gòu)于中杉金橋公司；引物購(gòu)自上海英俊生物科技有限公司。

1.3 收集標(biāo)本

治療4 周和8 周后使用3.6%的水合氯醛，按照每100 g 體重1 mL 麻醉大鼠，大鼠仰臥位固定后，沿劍突下斜行向上刺入2.5～3.0 cm 入心臟取血[16]，離心后取上清液；并留取肝臟勻漿提取上清液，以上標(biāo)本-86℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 病理 組織于4%的甲醛液中固定后切片、HE 染色觀察大鼠肝臟病理學(xué)變化。

1.4.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 血糖及肝功能指標(biāo)測(cè)方法為酶法。胰島素檢測(cè)采用雙抗體夾心法。

1.4.3 SREBP1、ACCα 及SCD1 mRNA 表達(dá)采用RT-PCR 檢測(cè) 取肝臟組織提取總RNA，進(jìn)行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物電泳完成后采集圖像，計(jì)算各條帶的熒光強(qiáng)度值，以β-actin 作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。每組重復(fù)試驗(yàn)3 次。

SERBP1 Primer：A:5'CGTTCGCCATAACCAAG TAGAG 3'，B:5'GGCGATGCTGTACACTGTTGA 3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度：126 bp；ACCαPrimer：A:5'AGCGCTA CCGTTCCTCTATCAA 3'，B:5'GCTGTAAGAAGCGG ATGTAGTCG 3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度:118 bp；SCD1 Primer:A:5'CATCGCCAACACCATGGCATT3'，B:5'TCTGGAA CATCATCACCAGCTTCTC3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度：186 bp；β-actin Primer:A:5'GTGACGAGGCCCAGAGCAAGA G-3'，B:5'ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度：123 bp。

1.4.4 Western blot 檢 測(cè)SREBP1，ACCα，SCD1 蛋白表達(dá) 取肝臟組織勻漿測(cè)定蛋白含量，定量后電泳，切取目標(biāo)蛋白，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h 后加入多克隆一抗，4℃過(guò)夜，洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的二抗孵育，洗滌后與發(fā)光試劑反應(yīng)，洗片后掃描圖像，計(jì)算各條帶的灰度值，以β-actin 作內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。每組重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，t檢驗(yàn)進(jìn)一步比較兩組間差異，顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 艾塞那肽治療后NAFLD 大鼠肝臟病理學(xué)改變

大鼠肝臟組織HE 染色顯示：HFD 組表現(xiàn)細(xì)胞變性及脂肪顆粒沉積；艾塞那肽干預(yù)后4 周后，各干預(yù)組脂肪顆粒均明顯減少，8 周時(shí)改變亦顯著，見(jiàn)圖1。

圖1 肝臟HE 染色變化圖（20×20）Fig.1 The pathological changes of liver by HE staining （20×20）

2.2 艾塞那肽治療后NAFLD 大鼠肝功能改變

2.2.1 艾塞那肽治療4 周、8 周后 艾塞那肽治療NAFLD 大鼠4 周和8 周后，大鼠天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT） 指標(biāo)明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1、表2。

2.2.2 胰島素抵抗指數(shù)的變化 艾塞那肽治療4周、8 周后，艾塞那肽三個(gè)治療組胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistant index，IRI） 較HFD 組下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 觀察艾塞那肽使用前后對(duì)NAFLD 大鼠脂肪酸基因表達(dá)的影響

2.3.1 SREBP1，ACCα，SCD1 mRNA 表達(dá)治療4 周、8 周后，SREBP1 及ACCαmRNA 表達(dá)逐漸下降，SCD1mRNA 表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖3、圖4。

2.3.2 SREBP1，ACCα，SCD1 蛋白表達(dá) 治療4 周、8 周后，SREBP1、ACCα 蛋白表達(dá)逐漸下降（P＜0.05）；SCD1 蛋白表達(dá)上升（P＜0.05），見(jiàn)圖5、圖6。

表1 治療4 周后大鼠肝功能比較［U/L，（±s）］Tab.1 Comparison of the liver function indicators after 4 weeks of treatment［U/L，（±s）］

表1 治療4 周后大鼠肝功能比較［U/L，（±s）］Tab.1 Comparison of the liver function indicators after 4 weeks of treatment［U/L，（±s）］

與HFD 組比較，*P ＜0.05；與PDC 組比較，#P ＜0.05。

表2 治療8 周后大鼠肝功能比較［U/L，（±s）］Tab.2 Comparison of the liver function indicators after 8 weeks of treatment［U/L，（±s）］

表2 治療8 周后大鼠肝功能比較［U/L，（±s）］Tab.2 Comparison of the liver function indicators after 8 weeks of treatment［U/L，（±s）］

與HFD 組比較，*P ＜0.05；與PDC 組比較，#P ＜0.05。

圖2 胰島素抵抗指數(shù)比較Fig.2 Comparison of the insulin resistance index

圖3 治療4 周后大鼠SREBP-1,ACCα 及SCD1 mRNA 表達(dá)Fig.3 SREBF-1c,ACCα and SCD1 mRNA expression in livers of rats after 4weeks of treatment

圖4 治療8 周后大鼠SREBP-1,ACCα 及SCD1 mRNA 表達(dá)Fig.4 SREBF-1c,ACCα and SCD1 mRNA expression in livers of rats after 4weeks of treatment

圖5 治療4 周后大鼠SREBP-1,ACCα 及SCD1 蛋白表達(dá)Fig.5 SREBF-1c,ACCα and SCD1 protein expression in livers of rats after 4 weeks of treatment

圖6 治療8 周后大鼠SREBP-1,ACCα 及SCD1 蛋白表達(dá)Fig.6 SREBF-1c,ACCα and SCD1 protein expression in livers of rats after 8weeks of treatment

3 討論

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD） 是一種與胰島素抵抗（insulin resistance，IR） 和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，包括一系列的嚴(yán)重程度，從簡(jiǎn)單的脂肪變性到更高級(jí)的形式，非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）[17-18]。NASH 發(fā)生在30%的NAFLD 患者中，它顯著增加了肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)[19]。據(jù)預(yù)測(cè)NAFLD 將成為肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因素。大量臨床證據(jù)表明，NAFLD與心血管疾病、慢性腎臟病和2 型糖尿病獨(dú)立相關(guān)[20]。

目前公認(rèn)NAFLD 病因研究是1998 年Day[21]提出的二次打擊學(xué)說(shuō)。第一次打擊主要是指肝臟細(xì)胞內(nèi)的脂肪顆粒過(guò)量積累，而胰島素抵抗可能貫穿于NAFLD 發(fā)病的全過(guò)程，是NAFLD 第一次打擊的始動(dòng)及中心環(huán)節(jié)。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白l(sterolregulatoryelement-bindingprotein-l，SREBP-l)作為脂肪生成轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，其通過(guò)參與脂肪酸和甘油三酯合成基因的活化來(lái)調(diào)節(jié)脂肪生成的過(guò)程[22]。SREBP1 介導(dǎo)脂肪生成相關(guān)甘油三酯合成和積累的表達(dá)[23-24]，SREBP1 可導(dǎo)致肝臟中過(guò)多的甘油三酯積聚，從而導(dǎo)致NAFLD 的發(fā)生[25]。

乙酰輔酶A 羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alphα，ACCα） 在脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)酶系的作用下合成長(zhǎng)鏈脂肪酸，促進(jìn)脂肪變性，造成脂肪顆粒在肝臟聚集，從而導(dǎo)致了NAFLD 發(fā)生[26]。硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase1，SCD-1） 是合成單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，參與脂肪肝的發(fā)病過(guò)程。胰島素抵抗時(shí)，SREBP-1過(guò)量表達(dá)，而SREBP-1 除可以控制脂肪代謝外，也是肝臟中所分泌調(diào)節(jié)脂肪代謝酶ACCα 和SCD-1 的調(diào)節(jié)酶，SREBP-1 的表達(dá)升高，會(huì)造成肝臟中ACCα 酶的過(guò)量表達(dá)，促使SCD1 酶表達(dá)降低，三個(gè)蛋白相互作用，相互影響，導(dǎo)致肝臟脂肪代謝障礙，最終造成非酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展[27]。而加劇脂肪肝進(jìn)一步發(fā)展的重要因素是氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[28]。當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度堆積到一定程度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，加速肝細(xì)胞損傷，最終發(fā)生肝纖維化和肝細(xì)胞死亡。本研究對(duì)艾塞那肽治療NAFLD 大鼠的作用進(jìn)行探討，結(jié)果顯示艾塞那肽治療NAFLD 大鼠4 周及8周后：PDC、ELD、EMD 以及EHD 四個(gè)干預(yù)組脂肪顆粒均明顯減少、肝功能指標(biāo)明顯下降，提示艾塞那肽可以明顯改善NAFLD 大鼠肝臟的病理狀態(tài)及肝功能；艾塞那肽三個(gè)治療組胰島素抵抗指數(shù)較HFD 組下降明顯（P＜0.05），PDC 組不明顯，提示艾塞那肽可改善胰島素抵抗，而PDC 對(duì)改善胰島素抵抗不明顯；艾塞那肽治療后NAFLD 大鼠的SREBP1 及ACCαmRNA 表達(dá)逐漸下降（P＜0.05），SCD1mRNA 表達(dá)明顯增加（P＜0.05），SCD1mRNA 表達(dá)在ELD、EMD、EHD 組呈逐步增加的趨勢(shì)，SREBP1mRNA 以及ACCαmRNA 則呈逐步降低的趨勢(shì)；SREBP1、ACCα 蛋白表達(dá)逐漸下降（P＜0.05），SCD1 蛋白表達(dá)上升（P＜0.05）。提示艾塞那肽和PDC 增加SCD1mRNA 和蛋白的表達(dá)，降低SREBP1 以及ACCα mRNA 和蛋白的表達(dá)，且與艾塞那肽劑量相關(guān)。說(shuō)明艾塞那肽和PDC 能增加SCD1 酶的活性，降低SREBP1 和ACCα 酶活性。

綜上所述，艾塞那肽可以通過(guò)降低NAFLD 大鼠SREBP1 以及ACCα 表達(dá)，升高SCD1 表達(dá)，降低胰島素抵抗，抑制脂肪變性發(fā)生和脂肪顆粒在肝臟內(nèi)的聚集，可能對(duì)NAFLD 大鼠有一定的治療作用，給臨床上尋找治療NAFLD 的有效藥物提供了一條新的思路。