江宇航，李宏偉，蔡賽波，林連兵，張棋麟，*

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650500)

蛋白酶是一類催化蛋白質(zhì)分解為蛋白胨、多肽和游離氨基酸的重要水解酶[1]。目前，已廣泛應(yīng)用于食品、造紙、清潔劑、飼料添加劑、醫(yī)藥、釀造、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域，是最重要的工業(yè)用酶之一[2-3]。蛋白酶種類繁多，來源廣泛，按其來源可大致分為植物、動(dòng)物和微生物蛋白酶3大類[4]。目前在工業(yè)上廣泛應(yīng)用的蛋白酶主要是植物蛋白酶和動(dòng)物蛋白酶，而這2類蛋白酶主要來源于動(dòng)物內(nèi)臟、植物果實(shí)與莖葉[5]，易受到自然因素、環(huán)境變化和產(chǎn)酶源自身生理特性等多種因素的影響，使其具有分離提純復(fù)雜，不易獲得、產(chǎn)量低下等劣勢(shì)[6-7]。隨著現(xiàn)代化工業(yè)對(duì)蛋白酶需求量的逐漸增大，尋找到具有高活性、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低廉等優(yōu)勢(shì)的蛋白酶來源變得刻不容緩[8]。人們通過對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的不斷挖掘和認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)部分微生物在代謝過程中能產(chǎn)生多種蛋白酶，且大量產(chǎn)蛋白酶菌株存在于獨(dú)特的環(huán)境中(如高海拔、重金屬暴露和加工食品等)。例如，在青藏高原采集的土壤中獲得了耐低溫(0～40 ℃能保持較高酶活性)皮氏類芽孢桿菌(Paenibacilluspeoriae)產(chǎn)蛋白酶菌株[3]，廢鉻革屑堆積土壤中的耐Cr3+蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)產(chǎn)蛋白酶菌株[9]，以及從某些谷類豆制品中分離得到的具有拮抗?fàn)I養(yǎng)因子的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)產(chǎn)蛋白酶菌株[10]。此外，細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶還具有類型豐富、穩(wěn)定性好、易大量生產(chǎn)等特點(diǎn)[3，9-11]。

昆蟲作為自然界中對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力最強(qiáng)、分布最廣、腸道微生物資源較為豐富的動(dòng)物類群，其腸道內(nèi)的細(xì)菌具有較高的多樣性和獨(dú)特性，顯示出多種生物學(xué)功能[12-13]。研究表明，昆蟲腸道細(xì)菌能分泌多種水解酶協(xié)助昆蟲進(jìn)行食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收，并降解利用淀粉、脂肪、纖維素、蛋白質(zhì)等大分子能量物質(zhì)[14]。其中，蛋白酶是昆蟲分解食物中蛋白質(zhì)的一類關(guān)鍵水解酶，大多為胞外蛋白酶，與植物蛋白酶相比，具有來源廣、菌株選育方便、菌體易培養(yǎng)、產(chǎn)量高、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)[15]。目前，已從昆蟲腸道中篩選出一批酶活性能優(yōu)良的產(chǎn)蛋白酶菌株。例如，Zhou等[16]從黑胸散白蟻(Reticulitermeschinensis)腸道中篩選獲得的霍氏腸桿菌(Enterbacterhormaechei)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)展現(xiàn)了高效的木質(zhì)素降解能力，且在55 ℃時(shí)仍保持較高活性；Wang等[17]從家蠶(Bombyxmori)中分離獲得多株不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)產(chǎn)堿性蛋白酶菌株，其具有良好的酸堿耐受性。隨著對(duì)昆蟲腸道菌群資源進(jìn)行深入挖掘，篩選具有酶活性高和酶學(xué)特性優(yōu)良的蛋白酶菌株是一項(xiàng)具有應(yīng)用前景的工作。

馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)隸屬鱗翅目、枯葉蛾科、松毛蟲屬，是我國(guó)歷史性的林業(yè)害蟲之一，廣泛分布于四川、安徽、陜西、海南、云南等多個(gè)省份[18]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)松毛蟲的研究主要集中在將其作為有害生物進(jìn)行防治，對(duì)其腸道微生物資源的研究與利用較少。研究表明，棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)[19]、煙夜蛾(Helicoverpaarmyworm)[20]、大豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)[21]等多種鱗翅目害蟲幼蟲腸道中存在芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、腸桿菌(Enterobacter)等多個(gè)種屬的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌。馬尾松毛蟲也是鱗翅目昆蟲，本研究目標(biāo)是通過傳統(tǒng)微生物分離純化技術(shù)，對(duì)馬尾松毛蟲幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行體外分離培養(yǎng)研究，以期從中篩選獲得高產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，并對(duì)多個(gè)蛋白酶活性較強(qiáng)的菌種進(jìn)行基本酶活特性(熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性)分析。

1 材料與方法

1.1 馬尾松毛蟲幼蟲腸道細(xì)菌的分離與純化

供試蟲源于2019年8月采自貴州省天柱縣，4～5齡健康幼蟲，通過cox1分子標(biāo)記進(jìn)一步確認(rèn)種名。取36頭齡期一致的健康幼蟲，試驗(yàn)前饑餓處理24 h，置于超凈工作臺(tái)上。用無菌水沖洗幼蟲體表3次，以去除異物，用75%乙醇均勻清洗幼蟲表面，再用0.1%的HgCl2清洗幼蟲表面30 s進(jìn)行消毒，最后用無菌水對(duì)幼蟲體表沖洗3次。于解剖鏡(奧林巴斯，日本)下迅速取出其腸道，裝入含有500 μL無菌水的1.5 mL無菌EP管中，研磨棒研磨勻漿，加無菌水至1 mL。迅速用無菌水按10倍梯度稀釋至10-6，取10-1、10-3、10-63個(gè)梯度菌液各100 μL，用涂布棒均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)、牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(BPDA)、LB培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(CA)上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。長(zhǎng)出菌落后，利用無菌接種環(huán)挑取單菌落，經(jīng)4次平板劃線最終得到純培養(yǎng)菌株。最后，將純化得到的單菌落進(jìn)行編號(hào)并置于裝液量為25 mL的無菌玻璃試管中，于37 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h，添加50%的甘油置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 細(xì)菌DNA的提取與菌種鑒定

將已編號(hào)的馬尾松毛蟲腸道細(xì)菌按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根，中國(guó))的操作步驟進(jìn)行DNA提取。以提取獲得的細(xì)菌基因組DNA為模版，選擇27F和1492R 2種通用引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系25 μL：MIX 12.5 μL，DNA模板1 μL，27F、1492R引物各0.5 μL，其余體系用無菌水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行切膠純化與雙向測(cè)序直至測(cè)通。將測(cè)序結(jié)果利用NCBI的BLAST在線服務(wù)器(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，選取得分最高、序列一致性在99%及以上的已知細(xì)菌種類確定目標(biāo)物種。

1.3 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選

利用酪蛋白選擇培養(yǎng)基，配方為：酵母粉2.5 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂20.0 g、酪蛋白10.0 g、KH2PO40.3 g、NaCl 1.0 g、MgSO40.5 g、無菌雙蒸水1 L。將鑒定到的單菌落接種于酪蛋白選擇培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，加入適量的三氯乙酸處理10 min，觀察有無水解圈，并利用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測(cè)量記錄。對(duì)初篩獲得的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。產(chǎn)酶量以水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)表示，具有酪蛋白水解圈的菌株確定為產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 細(xì)菌蛋白粗酶液制備

挑取具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌單菌落，37 ℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，按5%的接種量接種于裝有酪蛋白液體選擇培養(yǎng)基的250 mL玻璃錐形瓶中，于37 ℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。取發(fā)酵液置于裝液量為50 mL的無菌離心管中，10 000×g離心5 min，收集上清液，棄去菌體沉淀，得到蛋白粗酶液，密封放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 酶活性測(cè)定

將各細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白粗酶液按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)行酶活性測(cè)定：將酪蛋白溶液pH調(diào)節(jié)至7.0，吸取蛋白粗酶液和底物(酪蛋白溶液)各l mL，振蕩混勻，于40 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 min，加入2 mL 0.4 mol·L-1的三氯乙酸終止反應(yīng)，再10 000×g離心5 min，靜置10 min，棄去菌體沉淀；取上清液1 mL加入新的無菌玻璃管中，再加入5 mL 0.4 mol·L-1的Na2CO3溶液和1 mL的Folin-酚試劑，振蕩混勻，置于40 ℃恒溫水浴鍋中保溫發(fā)色20 min，利用722N可見分光光度計(jì)(上海儀電，中國(guó))測(cè)定660 nm的吸光度。以添加三氯乙酸終止起始反應(yīng)的一組為對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。酶活性單位：將每min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.6 蛋白酶熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性分析

選取蛋白酶活性最高的3個(gè)菌種(如同一菌種包含不同酶活性的菌株，則選取酶活性最高的菌株作為該菌種代表，開展后續(xù)試驗(yàn))，將各菌株單菌落接種于裝有酪蛋白液體選擇培養(yǎng)基的200 mL錐形瓶中，于37 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，獲得蛋白粗酶液，按以下處理進(jìn)行粗酶液熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性處理：(1)分別在30、35、40、45、50、55、60 ℃恒溫水浴處理10 min，自然冷卻至室溫，最高酶活性定義為100%，其余酶活性以所占最高酶活性的百分比表示；(2)分別調(diào)節(jié)粗酶液pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，于37 ℃溫育1 h，pH調(diào)回7.0，最高酶活性定義為100%，其余酶活性以所占最高酶活性的百分比表示。進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

產(chǎn)酶量和蛋白酶活性均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Microsoft Excel 2007對(duì)所測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析與繪制圖表，用IBM SPSS 22.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。采用one-way ANOVA的單因素方差分析和最小顯著差異法(least-significant difference， LSD)測(cè)驗(yàn)不同處理的蛋白酶活性與差異顯著性；采用Student’s t-test檢驗(yàn)細(xì)菌菌落直徑與水解圈直徑的差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道細(xì)菌的分離

從LB、NA、BPDA和CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得馬尾松毛蟲幼蟲腸道細(xì)菌96株，經(jīng)16S rDNA分子鑒定發(fā)現(xiàn)，這96個(gè)菌株為18個(gè)不同種屬的細(xì)菌，其中LB培養(yǎng)基14種，NA培養(yǎng)基6種，BPDA培養(yǎng)基7種，CA培養(yǎng)基5種(表1)。18種細(xì)菌分別隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)中的芽孢桿菌屬，變形菌門(Proteobacteria)中的亞硫酸桿菌屬(Sulfurobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。

2.2 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的篩選與酶活性

在酪蛋白選擇培養(yǎng)基上獲得6株具有清晰水解圈的菌株，其菌落直徑顯著(P<0.05)小于水解圈直徑，將其作為產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌(表2)。6個(gè)菌株均隸屬于芽孢桿菌屬，分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。產(chǎn)酶量和酶活性測(cè)定結(jié)果顯示：地衣芽孢桿菌(MW-39)的蛋白酶活性最佳，其產(chǎn)酶量和蛋白酶活性分別為6.95±0.49和(255.36±1.32)U·mL-1；其次為解淀粉芽孢桿菌(MW-1和MW-50)，其產(chǎn)酶量和酶活性最高為6.45±0.83和(193.85±1.86)U·mL-1；枯草芽孢桿菌(MW-4、MW-6、MW-32)菌株產(chǎn)酶量和酶活性最高分別達(dá)6.25±0.68和(165.81±1.23)U·mL-1。

2.3 蛋白酶的熱穩(wěn)定性與酸堿耐受性

地衣芽孢桿菌(MW-39)、解淀粉芽孢桿菌(MW-50)和枯草芽孢桿菌(MW-4)的蛋白粗酶液經(jīng)不同溫度處理后，在30～60 ℃蛋白粗酶液均保持較高活性，50 ℃時(shí)MW-39產(chǎn)生的蛋白酶活性為86.69%，MW-4產(chǎn)生的蛋白酶活性為74.65%，MW-50產(chǎn)生的蛋白酶活性為69.98%。經(jīng)60 ℃處理后MW-39、MW-4和MW-50產(chǎn)生的蛋白酶活分別下降至51.94%、42.63%和36.26%。且MW-39產(chǎn)生的蛋白粗酶液在45 ℃時(shí)，酶活性達(dá)到最高，為(295.36±2.63)U·mL-1(100%)，而MW-4和MW-50產(chǎn)生的蛋白粗酶液在40 ℃時(shí)，酶活性分別達(dá)到最高，為(196.25±1.85)U·mL-1和(223.68±1.69)U·mL-1(100%)(圖1-a)。經(jīng)過單因素方差分析與多重比較發(fā)現(xiàn)，MW-39、MW-4和MW-50產(chǎn)生的蛋白酶活性在不同的溫度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3—5)。3個(gè)菌株產(chǎn)生的粗蛋白酶在pH 4.0～11.0均保持一定的蛋白酶活性，在pH 4.0時(shí)，MW-39產(chǎn)的蛋白酶活性下降至58.37%，MW-4下降至41.89%，MW-50下降至49.65%；在pH 11.0時(shí)，MW-39、MW-4和MW-50產(chǎn)生的蛋白酶活性分別下降至36.56%、21.58%和28.76%。

MW-39，地衣芽孢桿菌；MW-4，枯草芽孢桿菌；MW-50，解淀粉芽孢桿菌。MW-39， Bacillus licheniformis; MW-4， Bacillus subtilis; MW-50， Bacillus amyloliquefaciens.圖1 馬尾松毛蟲腸道3種細(xì)菌產(chǎn)生的粗蛋白酶在不同溫度(a)和pH(b)的相對(duì)活性Fig.1 Relative activity of crude protease from three species bacteria in intestine of Dendrolimus punctatus larvae under different temperatures (a) and pH (b)

表3 不同溫度下地衣芽孢桿菌蛋白酶活性的單因素方差分析與多重比較

表4 不同溫度下枯草芽孢桿菌蛋白酶活性的單因素方差分析與多重比較

表5 不同溫度下解淀粉芽孢桿菌蛋白酶活性的單因素方差分析與多重比較

同時(shí)，MW-39和MW-50產(chǎn)生的蛋白粗酶液在pH 8.0時(shí)酶活性最高，分別為(285.65±1.93)U·mL-1和(218.39±2.39)U·mL-1(100%)，而MW-4產(chǎn)生的蛋白粗酶液在pH 7.0時(shí)酶活性達(dá)到最高，為(183.46±1.23)U·mL-1(圖1-b)。通過對(duì)pH 5.0～9.0的蛋白酶活性進(jìn)行單因素方差分析與多重比較發(fā)現(xiàn)，MW-39、MW-4和MW-50產(chǎn)生的蛋白酶活性在不同的pH下差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表6，7和8)。

表6 不同pH下地衣芽孢桿菌蛋白酶活性的單因素方差分析與多重比較

表7 不同pH下枯草芽孢桿菌蛋白酶活性的單因素方差分析與多重比較

表8 不同pH下解淀粉芽孢桿菌蛋白酶活性的單因素方差分析與多重比較

3 討論

本研究共分離獲得2門18種馬尾松毛蟲幼蟲腸道細(xì)菌，包括變形菌門和厚壁菌門，這與其他動(dòng)物類群腸道細(xì)菌組成具有一定相似性，特別是在科和屬的分類單元水平[22-23]。以前的研究對(duì)云南松毛蟲(Dendrolimushoui)幼蟲[24]腸道菌群分離結(jié)果顯示，腸桿菌科、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌是其腸道中占比較大的優(yōu)勢(shì)菌群。對(duì)草原毛蟲(Gynaephoraaureate)幼蟲[25]腸道細(xì)菌的分離發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬細(xì)菌是其腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，在這些鱗翅目昆蟲腸道中還分離到了嗜冷桿菌屬和亞硫酸桿菌屬細(xì)菌。此外，本研究在馬尾松毛蟲幼蟲腸道內(nèi)鑒定到的檸檬酸桿菌屬和泛菌屬等非腸道優(yōu)勢(shì)菌群在其他昆蟲腸道菌群中也有報(bào)道。例如，林勝等[26]從褐飛虱(Nilaparvatalugens)若蟲腸道中分離獲得泛菌屬的成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)，黃振東等[27]從德國(guó)小蠊(Blattellagermanica)腸道中分離獲得多株檸檬酸桿菌屬細(xì)菌。可見，不同昆蟲腸道內(nèi)存在部分相同細(xì)菌，這些細(xì)菌類群可能在昆蟲祖先時(shí)期就已定殖于腸道，為較原始的昆蟲腸道菌，這為我們了解昆蟲腸道菌群演化提供了信息。然而，由于地理環(huán)境、生存條件、取食方式等多種因素的影響，不同類群的昆蟲塑造了各自獨(dú)特的腸道菌種類。值得注意的是，由于分離培養(yǎng)法無法準(zhǔn)確模擬出昆蟲腸道菌的生長(zhǎng)環(huán)境，大量的腸道細(xì)菌種類還不能進(jìn)行宿主體外培養(yǎng)，可能有部分極具價(jià)值的產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌資源被忽視。隨著基于高通量測(cè)序的腸道微生物多樣性和宏基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們正在從海量基因組學(xué)數(shù)據(jù)中探索細(xì)菌的生物學(xué)特性，從而開發(fā)出匹配的培養(yǎng)基。如2015年，有研究者在《Nature Communications》上發(fā)表了根據(jù)16S rDNA序列直接對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)庫(kù)(http://komodo.modelseed.org/default.htm)[28]，為挖掘和利用腸道微生物資源提供了新的思路。此外，由于培養(yǎng)條件的限制，尚未對(duì)馬尾松毛蟲腸道中厭氧細(xì)菌進(jìn)行篩選。本研究所鑒定到的菌株大多為好氧細(xì)菌，其次為兼性厭氧細(xì)菌(如檸檬酸桿菌)。腸道是厭氧環(huán)境，厭氧菌的數(shù)量較為龐大，故挖掘腸道產(chǎn)蛋白酶厭氧菌菌株是一項(xiàng)有意義的工作。

芽孢桿菌是產(chǎn)蛋白酶的常見細(xì)菌屬，它們廣泛存在于昆蟲腸道和自然環(huán)境中，能分解蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)[29]。以往研究表明，芽孢桿菌中的許多細(xì)菌都具有產(chǎn)蛋白酶能力，主要包括解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)等[30]。本研究中蛋白酶活性最高的3種細(xì)菌均為芽孢桿菌，且其種類和以往研究報(bào)道的具有產(chǎn)蛋白酶能力的芽孢桿菌一致，表明芽孢桿菌在馬尾松毛蟲幼蟲腸道蛋白質(zhì)分解中起關(guān)鍵作用，昆蟲腸道中存在大量產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，尤其地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。另外，本研究在葡萄球菌和腸桿菌等細(xì)菌中，未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋白酶菌株，這與豐碩等[31]從小菌蟲(Alphitobiuslaevigatus)腸道中只獲得產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的結(jié)果類似。鄒昌瑞等[32]在柞蠶(Anthereapernyi)幼蟲腸道中篩選獲得的葡萄球菌和腸桿菌也不產(chǎn)蛋白酶。也有研究表明，腸桿菌屬的許多細(xì)菌能介導(dǎo)昆蟲對(duì)芽孢桿菌的敏感性，并能幫助昆蟲降解蛋白質(zhì)。因此，一些腸道細(xì)菌(如腸桿菌等)可能介導(dǎo)了馬尾松毛蟲腸道對(duì)食物中蛋白質(zhì)的分解。此外，部分產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌種屬顯示了在不同昆蟲類群腸道間的特異分布。例如，本研究的馬尾松毛蟲腸道中產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌為芽孢桿菌，云南松毛蟲腸道中產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌為霍氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei)[33]，德國(guó)小蠊腸道中產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌為Chryseobacteriummassiliae和粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)[27]，家蠶腸道中產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)[17]。這些證據(jù)表明，昆蟲腸道中產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌種類具有較高的多樣性和一定的種屬特異性。

酪蛋白選擇培養(yǎng)基和蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，馬尾松毛蟲幼蟲腸道的多株芽孢桿菌能產(chǎn)生高活性的蛋白酶，尤其以地衣芽孢桿菌蛋白酶活性表現(xiàn)最好，是Nadeem等[34]和劉海進(jìn)等[35]發(fā)現(xiàn)的地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶活性的1.5～2.5倍；解淀粉芽孢桿菌蛋白酶活性次之，與寧豫昌等[36]發(fā)現(xiàn)的解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的高產(chǎn)蛋白酶活性相似；枯草芽孢桿菌蛋白酶活性相較前兩者低，但是王東等[37]報(bào)道的枯草芽孢桿菌蛋白酶性的1.2～1.5倍。馬尾松毛蟲腸道細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶在pH 5.0～9.0具有相對(duì)較高的蛋白酶活性。其中，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶在pH 8.0時(shí)活性達(dá)到最高，為堿性蛋白酶；枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶在pH 7.0時(shí)活性最高，為中性蛋白酶。3種蛋白酶均能耐受pH 4.0和11.0的酸堿度，表明不同芽孢桿菌來源的蛋白酶最適酸堿條件不同。在生產(chǎn)應(yīng)用中，可根據(jù)實(shí)際酸堿環(huán)境選擇不同菌種來源的芽孢桿菌蛋白酶。此外，供試的3種芽孢桿菌蛋白酶活性在60 ℃仍然保持35%以上，尤其地衣芽孢桿菌蛋白酶活性仍高達(dá)50%以上，表明地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)生的蛋白酶具有較好的熱穩(wěn)定性。3種菌產(chǎn)生的蛋白酶活性均在40 ℃左右達(dá)到最高，這一結(jié)果與湖泊中發(fā)現(xiàn)的地衣芽孢桿菌[38]、豆粕中發(fā)現(xiàn)的枯草桿菌[10]，以及豬腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的解淀粉芽孢桿菌[36]的適宜蛋白酶活性溫度相似，表明不同生態(tài)環(huán)境和動(dòng)物腸道來源的芽孢桿菌具有相似的蛋白酶熱力學(xué)性質(zhì)。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，供試芽孢桿菌蛋白酶在偏堿性條件下的活性顯著高于偏酸性條件，與以往報(bào)道的地衣芽孢桿菌[39]、枯草芽孢桿菌[37]和解淀粉芽孢桿菌[36]蛋白酶為中性或堿性酶的研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，馬尾松毛蟲幼蟲腸道中的芽孢桿菌來源蛋白酶具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性，在工業(yè)化制備酶制劑方面顯示了巨大的應(yīng)用潛力。因此，未來細(xì)菌蛋白酶基因工程改良、優(yōu)質(zhì)菌株選育和蛋白酶大規(guī)模發(fā)酵制備等，應(yīng)優(yōu)先關(guān)注地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等芽孢桿菌屬細(xì)菌，尤其是能產(chǎn)高活性且具有較強(qiáng)耐熱和耐酸堿性能蛋白酶的地衣芽孢桿菌。

本研究通過傳統(tǒng)體外培養(yǎng)方法對(duì)馬尾松毛蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行研究，分離鑒定了一批不同種類的腸道細(xì)菌，以芽孢桿菌為主，其中地衣芽孢桿菌的蛋白酶活性最佳，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌次之，明確了多株/種細(xì)菌所產(chǎn)蛋白酶的適宜溫度和pH。值得注意的是，本研究所測(cè)試的蛋白酶學(xué)性質(zhì)僅為溫度和酸堿耐受性等基本指標(biāo)。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)和試驗(yàn)的需要，還應(yīng)關(guān)注更多與蛋白酶應(yīng)用目標(biāo)密切相關(guān)的酶學(xué)特性(如對(duì)重金屬、有機(jī)溶劑和農(nóng)藥等耐受能力)。另外，腸道產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌幫助昆蟲消化食物，本研究發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌作為馬尾松毛蟲腸道益生菌，可考慮將其作為防控馬尾松毛蟲災(zāi)害的靶標(biāo)。例如：針對(duì)產(chǎn)蛋白酶菌株，篩選其特異的噬菌體、克隆制備噬菌體裂解酶，開發(fā)低毒特異化學(xué)殺菌劑等，對(duì)馬尾松毛蟲為害林區(qū)進(jìn)行規(guī)律噴灑，破壞其腸道產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌功能，使馬尾松毛蟲失去或減弱消化能力，為馬尾松毛蟲防治提供新的思路。