岳建華，董 艷，李文楊，李 蒙，張 琰，*

(1.信陽農(nóng)林學院 園藝學院，河南 信陽 464100； 2.信陽市大別山區(qū)園藝植物遺傳改良重點實驗室，河南 信陽 464100； 3.信陽農(nóng)林學院 林學院，河南 信陽 464100)

百子蓮(Agapanthuspraecox)又稱藍百合，百子蓮科(Agapanthaceae)百子蓮屬(Agapanthus)多年生草本花卉，原產(chǎn)南非，可作鮮切花、盆花、花境和園林地被應用[1]。百子蓮觀賞價值高，抗逆性強，目前在上海已大量應用，我國中部地區(qū)也在逐步推廣。但由于其生長緩慢，播種、分株等繁殖方式難以滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求。體細胞胚胎發(fā)生是一種高效的離體再生途徑，培養(yǎng)基的激素[2]、碳源[3]、pH[4]等通過影響離體培養(yǎng)條件下外植體的激素代謝、糖代謝、脅迫信號等來調(diào)節(jié)細胞分裂、生長與分化，影響體胚誘導和發(fā)育[4-6]。目前，培養(yǎng)基激素、碳源的研究報道較多，毒莠定(picloram，PIC)特異性調(diào)控單子葉植物離體細胞胚性啟動[7]，已被證實為調(diào)控百子蓮體胚發(fā)生的關(guān)鍵激素類物質(zhì)[8-10]；質(zhì)量體積分數(shù)2%～3%的蔗糖可為體胚發(fā)生提供合適的能量和滲透壓，維持細胞膜的穩(wěn)定性[2]，可應用于百子蓮體胚誘導[8]。目前，一般將誘導百子蓮體胚發(fā)生的培養(yǎng)基pH在滅菌前調(diào)至5.6～5.8[8，11]。

激素、糖代謝和脅迫信號在植物體胚發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]。PIC對百子蓮愈傷組織、胚性愈傷組織誘導和胚性能力的保持均有重要影響[9]，可顯著影響吲哚乙酸(indole acetic acid，IAA)含量[10]，而IAA通過影響細胞極性建立胚性[5]。赤霉素(gibberellin，GA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、細胞分裂素(cytokinin，CTK)等顯著調(diào)控體胚發(fā)生效果[2，14-15]，油菜素甾醇(brassinosteroid，BR)、乙烯(ethylene)、茉莉酸(jasmonate，JA)等對體胚發(fā)生進程也具有重要影響[16]。不同植物、不同離體培養(yǎng)階段對碳源的需求不同，糖組分顯著影響體胚發(fā)生效率[17]。例如挪威云杉(Piceaabies)體胚發(fā)生過程中，在體胚成熟、干燥階段對蔗糖的需求量極大，在體胚成熟發(fā)育中期對淀粉含量需求較高[17]。植物體胚發(fā)生過程中的脅迫信號主要通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)表達，包括羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等[6，18]。合理強度的ROS可促進細胞脫分化和體胚形成[6]，提高H2O2含量可促進體胚發(fā)生[19]。植物細胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(peroxidase，POD)可清除ROS，維持胞內(nèi)生理平衡[5-6，18]?？寡趸富钚灾苯佑绊懼参锛毎摲只驮俜只南嚓P(guān)生理過程，例如寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)SOD活性上升，可促進胚性細胞的分化和早期胚胎發(fā)育[19]。

植物離體培養(yǎng)過程中，pH通過維持植物細胞生理代謝所需的弱酸性環(huán)境，影響激素含量、糖積累、ROS積累和抗氧化酶活性，以上因素對體胚發(fā)生的調(diào)控非常重要[5，18，20]，但pH對以上生理特性的調(diào)控效果卻鮮有報道，在百子蓮的研究中尚屬空白。本文擬研究不同pH處理下百子蓮體胚誘導效果，并初步揭示不同pH下百子蓮體胚內(nèi)源激素、糖類、活性氧和保護酶類的變化規(guī)律及其對體胚誘導效率的影響，豐富植物體胚發(fā)生理論。

1 材料與方法

1.1 試材

百子蓮購自南京市彩虹花卉公司，栽植于信陽農(nóng)林學院校內(nèi)實驗基地。2017年5～6月，選取5年生植株未開裂的小花苞，切取小花梗作為外植體進行愈傷組織誘導，誘導方法參照文獻[21]。愈傷組織每月繼代1次，7～9個月后，得到單細胞起源的胚性愈傷組織，繼代6個月后用于試驗研究。選取狀態(tài)一致、生長旺盛、顏色鮮黃、結(jié)構(gòu)疏松的胚性愈傷組織進行體胚幼胚(young somatic embryo，YSE)誘導，以YSE為試材進行體胚成熟胚(mature somatic embryo，MSE)誘導。

1.2 培養(yǎng)基配制與接種

在YSE、MSE誘導階段，將培養(yǎng)基pH分別調(diào)至5.6、5.8、6.0、6.2。幼胚誘導培養(yǎng)基為MS+30.0 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂，成熟胚發(fā)育培養(yǎng)基為MS+20.0 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂。培養(yǎng)基配置方法：稱取MS干粉(Phytotech Lab M519)4.43 g·L-1，超純水溶解后加蔗糖，充分混勻，1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)至目標pH，加瓊脂，121 ℃高壓滅菌25 min，冷卻至60 ℃左右于超凈工作臺內(nèi)分裝至90 mm × 16 mm玻璃培養(yǎng)皿，每皿倒25 mL左右，冷卻至室溫后接種。

1.3 培養(yǎng)條件

每皿培養(yǎng)基接種1.0 g材料，分為大小基本相同的9份，按3×3分布方式擺放至平板培養(yǎng)基中，每處理接種5皿，設(shè)3次重復。培養(yǎng)室溫度(25±2)℃，相對濕度65%左右，暗培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)至光周期14 h/10 h(L/D)下培養(yǎng)，光量子通量密度為50 μmoL·m-2·s-1。

1.4 觀察與計數(shù)

培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計體胚數(shù)量。YSE誘導階段，統(tǒng)計形態(tài)完整、尺寸大于1 mm的不透明狀胚胎數(shù)量。誘導的YSE轉(zhuǎn)接至MSE誘導培養(yǎng)基，30 d后統(tǒng)計數(shù)量，該階段統(tǒng)計具有明顯胚芽和胚根結(jié)構(gòu)、形態(tài)學上端為綠色、整體長度大于5 mm的胚數(shù)量。

1.5 生理指標測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定激素、糖類、活性氧與保護酶等生理指標，委托上海酶聯(lián)生物科技有限公司參照Pradko等[22]的方法進行測定。方法如下：稱取1.0 g鮮樣，加2 mL樣品提取液，冰浴勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL試管；4 ℃提取上清液，過C-18固相萃取柱；轉(zhuǎn)入5 mL離心管，真空冷凍干燥，樣品稀釋液定容；加標樣和待測樣，取標樣稀釋為梯度濃度(含0 ng·mL-1)，將標樣和待測樣加入96孔酶標板，每孔50 μL，待測樣設(shè)3次生物學重復；加一抗，將酶標板置入濕盒內(nèi)，37 ℃ 30 min后洗板，洗滌4次；加二抗，放入濕盒內(nèi)，置于37 ℃ 30 min；洗板后加底物顯色，每孔加50 μL 2 mol·L-1硫酸終止反應；用酶標儀測定標樣和樣品490 nm處的吸光度D490，根據(jù)標準曲線計算樣品含量或酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016、GraphPad Prism 5、Adobe Photoshop進行數(shù)據(jù)整理和作圖，用IBM SPSS Statistics 20進行顯著性檢驗(LSD法，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對體胚誘導效果的影響

由圖1可知，pH對百子蓮體胚誘導效果有顯著影響。不同pH處理下YSE誘導數(shù)量具有顯著差異，培養(yǎng)基pH 6.0利于YSE誘導，誘導數(shù)量約為每皿46個，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.2分別增加21.05%、17.20%和138.96%，差異顯著(P<0.05)(圖1-A)。如圖1-B所示，隨著pH(5.6～6.2)的升高，MSE數(shù)量逐漸增加。pH 6.2處理下，MSE數(shù)量可達每皿75個，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.0分別增加135.79%、40.88%和36.59%。綜上，YSE誘導和MSE誘導階段，較佳的pH分別為6.0和6.2。

n=3，柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。n=3. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖1 pH對體胚誘導效果的影響Fig.1 Effects of pH on somatic embryo induction

2.2 pH對體胚誘導內(nèi)源激素的影響

體胚誘導階段，pH對激素含量具有顯著影響(圖2)。與MSE階段相比，不同pH處理下YSE誘導階段內(nèi)源IAA含量相對較高，且在pH 6.0處理下達到最高，比pH 6.2處理增加25.31%，差異顯著(P<0.05)(圖2-A)。結(jié)合態(tài)IAA(binding IAA)含量受pH的影響較大，且與體胚誘導數(shù)量變化趨勢不一致(圖2-B)。IAA氧化酶活性與成熟胚數(shù)量變化規(guī)律一致，YSE階段在pH 6.0處理下IAA氧化酶活性較強，MSE階段在pH 6.2處理下IAA氧化酶活性較強(圖2-C)。GA含量在體胚誘導過程中變化顯著，尤其是GA4含量。YSE階段在pH 5.8處理中GA4含量較高；成熟胚階段在pH 6.2處理中GA4含量最高，分別比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.0增加26.44%、18.63%和28.39%，差異顯著(P<0.05)。YSE階段的GA1含量顯著高于MSE階段，YSE階段在pH 6.0處理中GA1、GA3含量最低，MSE階段在pH 6.2處理中GA1、GA3含量相對較低(圖2-E、F)。YSE階段在pH 5.8處理下BR含量顯著低于其他處理，MSE階段在pH 5.8和pH 6.0處理下BR含量顯著低于其他處理。相同pH處理下YSE階段的CTK含量普遍高于MSE階段，pH 5.6處理下YSE階段和MSE階段的CTK含量高于其他處理，其他處理間差異不顯著(P>0.05)。YSE階段和MSE階段不同處理的乙烯含量差異均不顯著(P>0.05)，表明百子蓮體胚中乙烯含量受pH影響較小。ABA含量受pH的影響較大，YSE階段和MSE階段分別在pH 6.0和pH 6.2處理中含量最高，且與體胚發(fā)生效率較為一致。YSE階段和MSE階段的JA含量均在pH 6.0處理中最低(圖2-L)。

圖2 pH對體胚誘導期內(nèi)源激素的影響Fig.2 Effects of pH on endogenous hormone in somatic embryo induction stage

2.3 pH對體胚誘導糖代謝的影響

圖3-A所示，YSE階段pH 6.0處理的淀粉含量比pH 5.6和pH 5.8處理分別顯著(P<0.05)增加26.48%和16.57%，pH 6.0處理的總糖含量也較高，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.2處理分別顯著增加26.37%、25.95%和27.20%(P<0.05)，而MSE階段，總糖含量隨pH升高而降低(圖3-B)。pH對蔗糖含量的影響顯著，YSE階段pH 6.0處理的蔗糖含量顯著高于其他處理，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.2處理分別顯著增加22.36%、41.57%和17.19%(P<0.05)；MSE階段蔗糖含量隨pH升高而升高，pH 6.2處理的蔗糖含量最高，比pH 5.6和pH 5.8分別顯著增加36.78%和29.12%(P<0.05)(圖3-C)。YSE階段，葡萄糖和麥芽糖含量在不同pH處理中的變化趨勢一致，在pH 5.8和6.0處理中葡萄糖和麥芽糖含量均顯著高于其他處理(P<0.05)(圖3-D、E)。YSE階段pH對果糖含量的影響較小，pH 6.2處理的果糖含量顯著(P<0.05)高于pH 5.6處理，其他處理間差異均不顯著(P>0.05)；MSE階段，pH 5.8處理的果糖含量顯著(P<0.05)高于pH 5.6和6.0處理，與pH 6.2處理的果糖含量差異不顯著(P>0.05)(圖3-F)。

2.4 pH對體胚誘導氧化脅迫的影響

體胚誘導階段，ROS積累受到pH影響顯著，YSE誘導階段pH 6.0和MSE誘導階段pH 6.2處理下，ROS強度在各處理中處于中等水平(圖4-A)。在YSE階段，pH 5.8和6.0處理的羥自由基(·OH)積累較多，顯著高于pH 5.6和6.2處理；成熟胚誘導階段，pH 5.6處理的·OH含量最高，顯著(P<0.05)高于其他處理，pH 6.2處理的·OH含量最低(圖4-B)。在YSE誘導階段，pH 6.0處理的H2O2含量顯著(P<0.05)低于其他處理，其他處理間差異不顯著(P>0.05)；在成熟胚誘導階段，pH 6.2處理下H2O2含量最高，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.0處理分別增加27.85%、30.83%和35.65%(圖4-C)。不同pH環(huán)境下，POD、CAT和SOD活性在YSE、MSE階段呈現(xiàn)出不同的趨勢。YSE誘導階段，不同pH處理的POD活性差異不顯著(P>0.05)；MSE階段，pH 6.2處理的POD活性最低，顯著(P<0.05)低于pH 5.6和6.0處理(圖4-D)。YSE誘導階段pH 6.0處理下，CAT、SOD活性較低，MSE階段pH 5.6和6.2處理下CAT、SOD活性相對較高(圖4-E、F)。

2.5 不同pH處理下各指標的相關(guān)性

為分析pH對體胚發(fā)生效果的影響，并揭示體胚誘導的生理變化規(guī)律，將pH、體胚誘導數(shù)量、生理指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表1與表2，表中僅顯示與體胚誘導數(shù)量相關(guān)性較強(Pearson相關(guān)系數(shù)>0.650)的生理指標。幼胚誘導階段，pH與其他指標的相關(guān)性均未達到顯著水平。YSE的誘導數(shù)量與IAA含量呈極顯著正相關(guān)，與GA1、JA含量和POD活性均呈顯著負相關(guān)；IAA含量與GA1含量和POD活性呈顯著負相關(guān)；GA1含量與JA含量和POD活性呈極顯著正相關(guān)，與H2O2含量呈顯著正相關(guān)；JA含量與H2O2含量和POD活性呈顯著正相關(guān)。幼胚誘導階段的相關(guān)性分析表明，內(nèi)源IAA含量可能是促進YSE數(shù)量的關(guān)鍵因子。

圖3 pH對體胚誘導期糖代謝的影響Fig.3 Effects of pH on carbohydrate metabolism in somatic embryo induction stage

圖4 pH對體胚誘導期活性氧積累與保護酶活性的影響Fig.4 Effects of pH on ROS accumulation and activity of protective enzymes in somatic embryo induction stage

成熟胚誘導階段，pH與成熟胚誘導數(shù)量、IAA氧化酶活性、蔗糖含量呈顯著正相關(guān)；成熟胚誘導數(shù)量與IAA氧化酶活性呈極顯著正相關(guān)，與羥自由基含量呈顯著負相關(guān)；IAA氧化酶活性也與羥自由基含量呈顯著負相關(guān)；GA4與H2O2含量呈顯著正相關(guān)；羥自由基含量與POD活性呈顯著正相關(guān)。GA4含量、蔗糖含量與MSE數(shù)量的相關(guān)性雖沒有達到顯著水平，但相關(guān)系數(shù)較高，推測GA4和蔗糖對MSE誘導較為重要。

表1 幼胚誘導階段體胚數(shù)量與生理指標的相關(guān)性分析

表2 成熟胚誘導階段體胚數(shù)量與生理指標的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

本研究表明，pH對百子蓮體胚發(fā)生過程中激素信號、糖代謝和氧化脅迫的發(fā)生強度有影響，進而影響體胚發(fā)生效果。百子蓮在YSE誘導和MSE誘導階段較佳的pH分別為6.0和6.2。IAA、GA4、蔗糖含量對體胚誘導、成熟具有重要作用，中等強度的氧化脅迫利于體胚發(fā)生。今后可從形態(tài)學、細胞學、生理學、分子生物學等角度進一步揭示不同pH環(huán)境下重要生理指標對百子蓮體胚發(fā)生的調(diào)節(jié)機制。

體胚發(fā)生各階段對培養(yǎng)基pH需求不同，胞內(nèi)pH變化可顯著影響細胞分裂、分化與生長[4]。百子蓮體胚發(fā)生培養(yǎng)基pH一般為5.6～5.8[11]，而本研究表明，百子蓮YSE和MSE誘導階段的較佳pH分別為6.0和6.2。體胚誘導早期，部分植物需要偏酸性的培養(yǎng)環(huán)境，隨體胚發(fā)育成熟，相對偏堿性培養(yǎng)條件利于胚和幼苗生長，從離體細胞到體胚成熟，百子蓮對培養(yǎng)基pH的需求呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢，與胡蘿卜(DaucuscarotaL.)[20]、朝鮮山芹(Ostericumkoreanum)[23]離體再生的研究結(jié)果一致。通常培養(yǎng)基pH會隨著培養(yǎng)時間延長逐漸降低，尤其是以瓊脂作為支撐物[24]，以百子蓮pH 5.8的培養(yǎng)基為例，培養(yǎng)30 d時培養(yǎng)基pH約為3.8～3.9，偏酸環(huán)境造成的脅迫對體胚發(fā)育不利，細微的pH變化對生長素等激素發(fā)揮作用也有影響[25]。

生長素是調(diào)控植物發(fā)育的重要激素[26]，內(nèi)源IAA是唯一具有極性運輸特性的植物激素[25]，極性運輸?shù)哪芰恳蕾囉诎麅?nèi)外pH梯度產(chǎn)生的質(zhì)子動力，環(huán)境pH可影響IAA的極性運輸[26-27]，IAA的運輸受到自身信號反饋[27]和pH的共同作用[25]。Dindas等[28]報道，胞外pH可通過調(diào)節(jié)擬南芥(Arabidopsisthaliana)根尖細胞H+和IAA-平衡改變細胞膜的極性，內(nèi)源IAA信號轉(zhuǎn)導受到pH梯度的顯著影響。培養(yǎng)基pH可通過調(diào)節(jié)離體細胞對生長素的攝取能力而影響培養(yǎng)效果[29]。本研究中，IAA含量及其代謝受到培養(yǎng)基pH的顯著影響，適宜的pH通過調(diào)節(jié)內(nèi)源IAA合成與信號轉(zhuǎn)導促進體胚誘導數(shù)量，在體胚發(fā)生中起到關(guān)鍵調(diào)控作用[5]。PIC是外源生長素類物質(zhì)，通過調(diào)控內(nèi)源IAA的合成與信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)體胚發(fā)生進程[10，30]，在水仙(Narcissuspseudonarcissus)[31]、郁金香(Tulipagesneriana)[7]和百子蓮[11]中具有高度的特異性。在體胚誘導階段，培養(yǎng)基去除PIC后會導致內(nèi)源IAA含量增加，IAA通過調(diào)控細胞極性結(jié)構(gòu)影響體胚誘導數(shù)量[30]。

GA在植物發(fā)育中具有重要功能，不具備極性運輸特性，GA和IAA信號存在互作，GA信號可影響IAA合成與信號轉(zhuǎn)導[32]。在小毛彩雀(Chaenorrhinumminus)種子萌發(fā)試驗中，pH能夠影響GAs生物合成和功能發(fā)揮[33]。GA對體胚發(fā)生的效果因物種而異，多數(shù)研究表明，GA對體胚誘導不利[14-15]，例如GA3不利于紫花苜蓿(Medicagosativa)[34]、天竺葵(Pelargonium×hortorumBailey)體胚發(fā)生[14]，而GA1、GA4利于胡蘿卜體胚同步化[15]。GA1和GA4是植物主要活性內(nèi)源GAs，百子蓮中主要為GA4，在花芽、株高發(fā)育中均具有重要功能[32，35]，相對于GA1，GA4含量與百子蓮體胚發(fā)生效果一致，具有正向調(diào)節(jié)功能。在體胚發(fā)育后期，GA4可通過調(diào)控細胞分裂和伸長促進體胚成熟與幼苗形態(tài)建成[15]，本研究中YSE誘導和MSE誘導階段GA4與體胚數(shù)量均具有較強的相關(guān)性。

碳源可維持細胞滲透壓、提供細胞骨架、參與能量代謝與信號轉(zhuǎn)導，同時維持細胞膜完整性，是影響植物體胚發(fā)生的重要因素[17]，其種類和水平在體胚的誘導和發(fā)育成苗過程中有重要作用[3，17]。細胞內(nèi)源糖代謝不僅依賴外源供給，還受胞內(nèi)糖組分利用規(guī)律的影響[17，36]，而pH顯著影響植物糖代謝[37]，pH可通過影響真核細胞中磷酸化作用，改變淀粉等糖類代謝、蛋白質(zhì)積累，從而影響體胚發(fā)生過程[5，20，38]。淀粉積累通?？勺鳛轶w胚發(fā)生中的重要事件[36，39]，IAA等激素在蔗糖和淀粉的轉(zhuǎn)換中起重要調(diào)控作用，IAA、GA對淀粉的積累和蔗糖代謝具有顯著調(diào)節(jié)作用[2，40-41]。在甘蔗(Saccharumspp.)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、土豆蔻(Kelussiaodoratissima)、橡膠(Heveabrasiliensis)體胚誘導過程中，由于胞內(nèi)糖代謝的變化，碳源的種類和濃度對體胚發(fā)生效果均有顯著影響[3，36，42-43]。本研究中，體胚發(fā)育階段蔗糖含量與MSE數(shù)量相關(guān)性較高，而淀粉、麥芽糖含量較高時，百子蓮YSE誘導數(shù)量也達到較高水平。

脅迫信號和激素、糖代謝之間存在復雜的平衡關(guān)系[18]。離體培養(yǎng)中適宜的pH導致適度脅迫的發(fā)生，有利于IAA極性運輸和胞內(nèi)pH梯度建立，最終建立細胞全能性[5，17]，而生長素對非生物脅迫具有重要的調(diào)節(jié)效果[27]。培養(yǎng)基蔗糖滲透壓、pH和脅迫條件對細胞發(fā)育過程具有重要貢獻[4，17]。最近研究證實，ROS可通過活性羰基(reactive carbonyl species，RCS)影響生長素信號轉(zhuǎn)導調(diào)控植物發(fā)育，與生長素具有協(xié)同作用[44]。高濃度的H2O2會誘發(fā)逆境響應激素的積累，比如ABA、乙烯等，對體胚發(fā)育成熟具有促進作用[18]。體胚發(fā)生過程中，POD活性顯著增加，參與細胞防御反應，細胞全能性一旦建立，脅迫程度也相應減弱，細胞膜完整性得以有效保持，利于提高體胚發(fā)生質(zhì)量[36]。本研究中YSE和MSE階段對逆境響應和對pH變化的耐受能力存在差異，H2O2含量、POD活性與體胚發(fā)生效果相關(guān)性較強，表明適宜的pH能有效調(diào)節(jié)脅迫強度與保護酶活性的平衡，利于植物細胞代謝與器官發(fā)育[45]。