武秋穎，張運(yùn)峰，張淑紅，高鳳菊，劉海英，范永山，*

(1.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山063000； 2.唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，河北 唐山 063000)

目前，人工栽培的食用菌品種大多是通過自然選育、雜交育種、誘變育種等方法培育獲得。自然選育受到環(huán)境、資源限制，很難盡快獲得目標(biāo)性狀；雜交育種需要單孢分離和交配型鑒定，并且篩選優(yōu)質(zhì)雜交后代的工作量非常大；誘變育種的技術(shù)操作簡單，但篩選量大且突變性狀的遺傳穩(wěn)定性較差[1-2]?；蚬こ逃N和分子標(biāo)記育種也有了一定的應(yīng)用研究，但食用菌的全基因組測序工作嚴(yán)重滯后，缺乏對食用菌染色體復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及其調(diào)控機(jī)制的研究，嚴(yán)重限制了基因工程技術(shù)在食用菌育種方面的應(yīng)用[3]。原生質(zhì)體融合技術(shù)不但能使食用菌保持其優(yōu)質(zhì)性狀，而且能夠與其他食用菌的優(yōu)良性狀相結(jié)合，可快速表現(xiàn)出新的優(yōu)良特性；直接以生產(chǎn)性狀為篩選指標(biāo)，避免了繁雜的遺傳標(biāo)記：因此，被廣泛應(yīng)用于金針菇[4]、羊肚菌[5]、猴頭菌[6]等食用菌的新品種選育。平菇味道鮮美，且具有高產(chǎn)和強(qiáng)抗雜菌污染能力的優(yōu)勢[7]；杏鮑菇有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療作用[8-9]，以優(yōu)質(zhì)和菌絲強(qiáng)壯、生長旺盛、適應(yīng)性強(qiáng)為主要特征。本文擬利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，獲得具有優(yōu)良互補(bǔ)性狀的平菇和杏鮑菇新菌株，發(fā)揮其潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株

平菇CCEF89(CCMSSC00389)來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所國家食用菌標(biāo)準(zhǔn)菌株庫。杏鮑菇PL7由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院李明教授饋贈。

1.2 原生質(zhì)體制備

取在25 ℃ PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d的幼嫩菌絲于1.5 mL無菌離心管中，按照李小六等[10]的方法分別制備平菇CCEF89和杏鮑菇PL7菌株的原生質(zhì)體。利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，利用1%中性紅染色進(jìn)行原生質(zhì)體死活鑒定，計(jì)算活體原生質(zhì)體濃度。

1.3 原生質(zhì)體融合

用終濃度為0.01 mol·L-1Ca2+溶液配制的不同質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(25%、30%、35%和40%)的PEG6000作為促融劑。用0.6 mol·L-1甘露醇(穩(wěn)滲劑)將平菇CCEF89和杏鮑菇PL7原生質(zhì)體濃度配制成1×106mL-1，按照1∶1的比例加入1.5 mL無菌離心管中，加入等體積促融劑，在32 ℃水浴下進(jìn)行融合，顯微觀察不同水浴時(shí)間(10、20、30、40、50 min)的原生質(zhì)體融合情況。融合率(%)=融合細(xì)胞數(shù)/親本細(xì)胞數(shù)×100。當(dāng)觀察到90%左右的原生質(zhì)體出現(xiàn)啞鈴型融合細(xì)胞時(shí)，978×g離心2 min。用穩(wěn)滲劑洗去促融劑，洗2～3次。取0.2 mL融合溶液接種到1 mL蔗糖-蛋白胨培養(yǎng)基(蔗糖20 g，蛋白胨5 g，穩(wěn)滲劑1 000 mL)，25 ℃避光靜置培養(yǎng)24 h后，按每皿0.2 mL涂布到蔗糖-蛋白胨-瓊脂培養(yǎng)基(蔗糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂16 g，穩(wěn)滲劑1 000 mL)平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察融合菌株的再生情況。將培養(yǎng)基上產(chǎn)生的單菌落分別轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，通過觀察菌落形態(tài)和菌絲特征，獲得融合后的純培養(yǎng)菌株。

1.4 拮抗試驗(yàn)篩選融合菌株

將融合后的純培養(yǎng)菌株與2個(gè)親本菌株按照劉海英等[11]的方法進(jìn)行拮抗反應(yīng)試驗(yàn)，篩選出與親本菌株均具有明顯拮抗反應(yīng)的融合菌株。

1.5 融合菌株的鑒定

按照劉海英等[11]的方法對融合菌株和親本菌株進(jìn)行Rep-PCR分子鑒定，篩選出與親本菌株具有不同基因型的融合菌株進(jìn)行出菇試驗(yàn)。

1.6 出菇試驗(yàn)

按照劉海英等[11]的方法對融合菌株進(jìn)行出菇試驗(yàn)，觀測菌絲在培養(yǎng)基的吃料和污染情況，記錄不同菌株開始出現(xiàn)原基的時(shí)間和子實(shí)體特征，計(jì)算第1茬菇產(chǎn)量和總生物學(xué)效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇CCEF89菌株和杏鮑菇PL7菌株的原生質(zhì)體制備

按照李小六等[10]的方法制備2個(gè)親本菌株的原生質(zhì)體，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平菇CCEF89和杏鮑菇PL7的原生質(zhì)體平均濃度分別為4.97×107mL-1和3.45×107mL-1。利用1%中性紅染色檢測原生質(zhì)體活性，發(fā)現(xiàn)平菇CCEF89具有活性的原生質(zhì)體數(shù)占60.1%，杏鮑菇PL7占77.5%。因此，平菇CCEF89和杏鮑菇PL7的活體原生質(zhì)體濃度分別為2.99×107mL-1和2.67×107mL-1。

2.2 平菇CCEF89菌株和杏鮑菇PL7菌株的原生質(zhì)體融合

2.2.1 PEG濃度對原生質(zhì)體融合的影響

顯微觀察原生質(zhì)體融合時(shí)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)原生質(zhì)體膜相互接觸，可見到明顯的啞鈴型融合細(xì)胞。在PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，原生質(zhì)體有破碎現(xiàn)象(圖1-A)；當(dāng)PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，原生質(zhì)體比較正常(圖1-B)；PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)高于30%時(shí)，原生質(zhì)體有縮小現(xiàn)象(圖1-C、D)。通過融合率測定，在融合時(shí)間50 min內(nèi)，PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，出現(xiàn)啞鈴型細(xì)胞的比例不足0.01%，PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，啞鈴型細(xì)胞出現(xiàn)的比例最高，為0.03%，PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為35%和40%時(shí)，啞鈴型細(xì)胞出現(xiàn)的比例較低，為0.01%～0.02%。

另外，啞鈴型細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間也隨PEG濃度變化有所不同。當(dāng)PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，啞鈴型細(xì)胞出現(xiàn)需40～50 min；當(dāng)PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為30%、35%和40%時(shí)，在10～20 min內(nèi)就可觀察到啞鈴型細(xì)胞和融合細(xì)胞。綜合考慮以上試驗(yàn)結(jié)果，在供試的4種PEG濃度中，30% PEG對原生質(zhì)體的形態(tài)沒有顯著影響，啞鈴型細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間短、比例高，因此，平菇CCEF89和杏鮑菇PL7原生質(zhì)體融合的適宜PEG質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為30%。

2.2.2 融合時(shí)間對原生質(zhì)體融合的影響

利用30%PEG促融劑，32 ℃水浴，將平菇CCEF89和杏鮑菇PL7的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，融合時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，顯微鏡下觀察融合情況，計(jì)算每100 μL融合液再生的融合菌株數(shù)量。結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，0～30 min，隨著融合時(shí)間的延長，融合菌株的數(shù)量顯著增加，融合時(shí)間為30～40 min時(shí)，融合菌株數(shù)量達(dá)到最多，融合時(shí)間為50 min時(shí)，融合菌株數(shù)量顯著下降。考慮到融合時(shí)間過長可能會影響融合子再生，因此，平菇CCEF89和杏鮑菇PL7原生質(zhì)體融合的適宜時(shí)間為30 min。在最佳融合條件下，即兩親本原生質(zhì)體數(shù)量按1∶1混合，30% PEG 6000，0.01 mol·L-1Ca2+，32 ℃水浴30 min，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，融合率達(dá)0.010 1%～0.028 2%。

2.3 原生質(zhì)體融合菌株鑒定

2.3.1 拮抗反應(yīng)試驗(yàn)

通過原生質(zhì)體融合，共獲得了515個(gè)融合再生菌株。分別將融合菌株與雙親接種于同一PDA平板培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌絲體與親本菌株菌絲體間有隆起的柵欄狀“?！?，說明融合子與親本間的拮抗作用十分顯著(圖3)。利用拮抗反應(yīng)試驗(yàn)，與兩親本菌株都表現(xiàn)明顯拮抗反應(yīng)的菌株有12個(gè)(占融合再生菌株總數(shù)的2.3%)，分別命名為P1～P12。

A， 25% PEG; B， 30% PEG; C，35% PEG; D， 40% PEG.圖1 PEG濃度對平菇CCEF89和杏鮑菇PL7原生質(zhì)體融合的影響(10×40倍)Fig.1 Effects of PEG concentration on the protoplast fusion of P.ostreatus CCEF89 and P. eryngii PL7(10×40)

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.圖2 融合時(shí)間對平菇CCEF89和杏鮑菇PL7原生質(zhì)體融合的影響Fig.2 Effects of fusion time on the protoplast fusion of P. ostreatus CCEF89 and P. eryngii PL7

圖3 融合菌株P(guān)3與親本菌株的拮抗反應(yīng)Fig.3 Antagonistic reaction test of protoplast fusant P3 and their parents

2.3.2 Rep-PCR分子鑒定

將杏鮑菇PL7和平菇CCEF89、融合菌株P(guān)1～P12分別用REP-1R、REP-2I、BOX、ERIC引物進(jìn)行Rep-PCR擴(kuò)增，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分析融合菌株與親本菌株的共有條帶和差異條帶，采用DPS (version 7.05版)軟件聚類距離Jaccard計(jì)算遺傳距離，利用0-1數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類UPGMA法進(jìn)行聚類分析，建立聚類樹狀圖。結(jié)果表明，所有融合菌株都產(chǎn)生了與親本菌株不同的擴(kuò)增條帶(圖4)，即具有與親本菌株不同的基因型。聚類分析結(jié)果表明，供試菌株間遺傳距離為0.142 9～0.805 6，平均遺傳距離為0.500 8，表明供試菌株間有較明顯的遺傳差異(圖5)。當(dāng)遺傳距離為0.530 0時(shí)，可將融合菌株和親本分為4類：第1類為PL7；第2類包括CCEF89、P2、P3、P4、P5、P6、P8、P9、P10、P12；第3類包括P7、P11；第4類為P1。聚類分析結(jié)果表明，通過原生質(zhì)體融合，產(chǎn)生了與親本菌株有顯著區(qū)別的新型基因型的菌株。

P1～P12為融合菌株，CCEF89為親本平菇，PL7為親本杏鮑菇。下圖同。P1-P12 were protoplast fusants， CCEF89 was P. ostreatus，PL7 was P. eryngii. The same as below.圖4 融合菌株的Rep-PCR分子鑒定(引物REP-2I)Fig.4 Molecular identification of protoplast fusants by Rep-PCR (primer REP-2I)

黑色線位置為遺傳距離0.530 0。The genetic distanceof the black lineposition is 0.530 0.圖5 基于Rep-PCR分子鑒定的融合菌株與親本菌株聚類分析Fig.5 Clustering analyses of protoplast fusants and their parents based on the molecular identification of Rep-PCR

2.4 融合菌株的出菇試驗(yàn)

2.4.1 子實(shí)體鑒定結(jié)果

出菇試驗(yàn)和子實(shí)體鑒定結(jié)果表明，融合菌株P(guān)1、P5為杏鮑菇，菇蓋顏色較親本PL7深，菌柄較短，略呈保齡球狀。其余10個(gè)融合菌株均為平菇，小菇蕾為黑色，隨著子實(shí)體長大，9～12 ℃時(shí)菇蓋為深褐色、黑色，26～28 ℃時(shí)菇蓋為淺褐色至褐色，與親本CCEF89不同的是菇蓋表面有一層膠質(zhì)。

2.4.2 杏鮑菇新菌株的栽培特性分析

出菇試驗(yàn)顯示，杏鮑菇新菌株P(guān)1、P5第1茬菇產(chǎn)量比親本菌株P(guān)L7分別提高了16.1%和22.6%，總生物學(xué)效率分別提高了19.5%和22.6%(出菇情況見圖6)。制備300袋以棉籽皮為唯一基質(zhì)的栽培袋，每袋裝干料500 g，P1、P5和PL7菌株分別接種100袋后進(jìn)行栽培培養(yǎng)，15 d后測定其污染率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親本菌株P(guān)L7相比，杏鮑菇新菌株P(guān)1、P5栽培袋的污染率分別下降了38.2%和41.1%，抗雜能力顯著提高(表1)。

表1 杏鮑菇新菌株與親本菌株的栽培特性比較

圖6 杏鮑菇親本與新菌株出菇情況Fig.6 Mushroom of P. eryngii parent and new strains

2.4.3 平菇新菌株的栽培特性分析

平菇融合菌株在原種培養(yǎng)基和栽培種培養(yǎng)基中菌絲呈白色，粗壯濃密。除了P3、P6、P7、P9外，其他6個(gè)菌株長滿培養(yǎng)料的時(shí)間比親本CCEF89顯著減少，平均縮短3.2～4.3 d。除了P3、P6、P7、P8、P9外，其他5個(gè)菌株形成原基的時(shí)間比親本CCEF89顯著減少，平均縮短4.3～7.3 d；總生物學(xué)效率提高12.11%～27.67%，出菇情況見圖7。第1茬平均產(chǎn)量增加0.05～0.12 kg·棒-1(干料500 g)，提高10.0%～24.0%。其中P4、P10、P11表現(xiàn)優(yōu)異，被確定為平菇優(yōu)良新菌株。

表2 平菇新菌株與親本菌株的栽培特性比較

圖7 平菇親本與新菌株出菇情況Fig.7 Mushroom of P.ostreatus parent and new strains

3 結(jié)論與討論

原生質(zhì)體融合技術(shù)可以打破細(xì)胞壁障礙，提高基因重組頻率；因此，在創(chuàng)新種質(zhì)資源和培育食用菌品種方面具有操作簡單、周期短、目標(biāo)明確、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)勢[12]。隨著原生質(zhì)體融合技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了食用菌種內(nèi)、種間、屬間，甚至科間的原生質(zhì)體融合，并選育出了許多食用菌新品種，例如康林芝等[4]利用金針菇(Flammulinavelutipes)與平菇(P.ostreatus)原生質(zhì)體融合，選育出了金針菇新品種F1P8。在原生質(zhì)體融合育種方面，平菇是應(yīng)用最廣的食用菌品種，與松乳菇(Lactariusdeliciosus)[13]、香菇(Lentinusedodes)[14]、秀珍菇(P.pulmonarius)[15]、紅平菇(P.djamor)[16]等許多食用菌都有關(guān)于原生質(zhì)體融合育種的報(bào)道。本文利用杏鮑菇與平菇進(jìn)行原生質(zhì)體融合，成功獲得了具有雙親優(yōu)良性狀的融合菌株，說明平菇具有優(yōu)良的遺傳特性，非常適合作為原生質(zhì)體融合的種質(zhì)材料。

原生質(zhì)體融合主要有化學(xué)法、電融合、激光誘導(dǎo)融合3種方法[12]。電融合和激光誘導(dǎo)融合雖然融合率較高，但對儀器設(shè)備和融合技術(shù)的要求也高，因此，在實(shí)踐過程中，PEG-Ca2+化學(xué)法的應(yīng)用更廣泛。本文結(jié)果表明，平菇與杏鮑菇原生質(zhì)體(1×106mL-1)按數(shù)量比1∶1混合后，在30% PEG 6000和0.01 mol·L-1Ca2+作用下，32 ℃水浴30 min，融合率可達(dá)0.010 1%～0.028 2%。該結(jié)果與秀珍菇和榆黃蘑原生質(zhì)體融合的適宜條件(35% PEG 4000，30 ℃水浴60 min)[17]、松乳菇與平菇原生質(zhì)體融合的適宜條件(2種原生質(zhì)體數(shù)量按1∶1混合，30% PEG 4000，30 ℃融合30 min)[13]相似，但融合率比松乳菇與平菇原生質(zhì)體融合(0.004 85%)提高了2.08～5.81倍。

目前采用的半滅活或雙滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，主要是有利于篩選融合子。采用的原生質(zhì)體滅活方法主要是熱滅活、紫外線滅活和化學(xué)藥劑滅活，即采用物理或化學(xué)的方法使原生質(zhì)體既保持染色質(zhì)活力又失去再生能力[18-19]。但是找到適于某一雜交組合的物理或化學(xué)方法，是一個(gè)既耗時(shí)又耗力的工作，因?yàn)楹芏辔锢砘蚧瘜W(xué)因素都會造成染色體損傷，從而影響融合率和融合菌株的遺傳穩(wěn)定性。本文采用的非滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，保持了兩親本的原生質(zhì)體活力，使親本的優(yōu)良遺傳基因能夠在融合過程中得到完整地保存和傳遞，并且通過拮抗反應(yīng)試驗(yàn)、Rep-PCR分子檢測和出菇試驗(yàn)可以準(zhǔn)確地鑒定融合菌株，能夠同時(shí)獲得2個(gè)親本性狀均得到改良的新菌株，減少了外界因素對融合過程的影響，并且提高了育種效率，可獲得更多的種質(zhì)資源，更有利于新品種的篩選和鑒定。本文采用非滅活的原生質(zhì)體融合技術(shù)，獲得了12株平菇與杏鮑菇的原生質(zhì)體融合菌株，并且篩選出了具有雙親優(yōu)良性狀的2個(gè)杏鮑菇新菌株和3個(gè)平菇新菌株，節(jié)約了育種時(shí)間和育種成本，提高了育種效率，有利于同時(shí)進(jìn)行2種不同食用菌的種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育。