陳繼銘 吳曉靜 劉田豐 陳海聰 黃成碩

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科中心，廣東湛江， 524023)

草次酸是甘草中天然產(chǎn)物甘草酸的三萜苷元成分[1,2]。甘草次酸的藥理作用有：抗炎[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗病毒[6]、保肝[7]和促進(jìn)胰島素吸收[8]等。甘草次酸在抗炎護(hù)肝作用中均顯示出較好活性[9-11]。甘草次酸有顯著的抗氧化作用，可抑制四氯化碳生成游離基及過氧化脂質(zhì)[12-14]。甘草次酸可通過增強(qiáng)Nrf2核轉(zhuǎn)錄及下游目的基因調(diào)控，緩解四氯化碳皮下注射誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的作用，從而影響體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡[15]。另外，四氯化碳對(duì)小鼠致肝損傷的動(dòng)物模型可造成骨質(zhì)疏松，其原因可能與肝受損不能合成某些蛋白或是細(xì)胞因子有關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)建立四氯化碳致小鼠肝損傷的動(dòng)物模型，觀察甘草次酸在護(hù)肝的同時(shí)，是否具有預(yù)防四氯化碳致小鼠肝損傷后出現(xiàn)的骨丟失作用，為其應(yīng)用于臨床防治肝性骨病提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只普通級(jí)昆明種10周齡的小白鼠，體質(zhì)量(32.42±4.27)g，雌雄各半。購(gòu)買于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證為：SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

藥物：甘草次酸(西安富捷藥業(yè)有限公司，20160930)；四氯化碳(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)，用食用花生調(diào)和油配制成40%(體積分?jǐn)?shù))的四氯化碳油溶液。

實(shí)驗(yàn)儀器：賽多利斯BT 25S電子天平(德國(guó)Sartorius)；Micro CT儀(SCANCO Medical AG，型號(hào)viva CT40)；Eppendorf 5415R小型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。

試劑：谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒(ALT)和丙二醛測(cè)試盒(MDA)，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠按體重隨機(jī)分成3組，每組8只。具體為(1)對(duì)照組(CON)：皮下注射0.1mL/10g花生油，每5d注射一次，首劑加倍，灌胃10ml/kg/d蒸餾水；(2)模型組(MOD)：皮下注射0.1mL/10g的40%(體積分?jǐn)?shù))四氯化碳花生油溶液，每5d注射1次，首劑加倍，灌胃10ml/kg/d蒸餾水；(3)甘草次酸(GA)：按模型組同法造模，灌胃50mg/kg/d甘草次酸。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境相同，自由飲水及進(jìn)食，每隔一周稱1次體重。實(shí)驗(yàn)連續(xù)四周，于結(jié)束前一天禁食12h，后摘眼球取血，分離血清測(cè)定ALT；取肝臟稱重并制備肝勻漿測(cè)MDA；取右側(cè)脛骨進(jìn)行Micro CT掃描。

1.3 主要觀察指標(biāo)

1.3.1 小鼠肝臟系數(shù)的計(jì)算[16]

肝臟系數(shù)=肝臟重量(g)/小鼠體重(g)×100%。

1.3.2 血清ALT活性的檢測(cè)

小鼠血樣3000r/min離心10min，取血清，按試劑盒說明測(cè)定。

1.3.3 肝勻漿MDA活性的檢測(cè)

稱取肝臟相同部位0.2g，用1.8mL冷生理鹽水制10%肝勻漿，按試劑盒說明測(cè)定。

1.3.4 脛骨Micro CT檢測(cè)

小鼠脛骨Micro CT掃描[16]：電流114μA，電壓70kVp，掃描時(shí)間為24.8min，間隔時(shí)間為200ms，分辨率為中度。進(jìn)行角度為180?倖的投射，對(duì)同一樣品掃描獲得500張不同截面的1024×1024像素的圖片，對(duì)于脛骨選取距生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1mm，層厚2mm的骨組織為興趣區(qū)域進(jìn)行三維重建。經(jīng)分析得到參數(shù)[17]：骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)，骨小梁數(shù)量(Tb.N)，骨小梁分離度(Tb.Sp)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨組織礦物密度(BMD)、連接密度(Con.D)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)以及各向異性的程度(DA)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重的變化

如表1所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CON組小鼠實(shí)驗(yàn)后體重增加8.54%，MOD組小鼠實(shí)驗(yàn)后體重增加0.36%，GA組小鼠實(shí)驗(yàn)后體重增加6.91%。

表1 小鼠體重的變化

2.2 小鼠肝臟指數(shù)的變化

如表2所示，與CON組比較，MOD組小鼠肝臟指數(shù)增加了31.78%(P<0.05)。與MOD組相比，GA組的肝臟指數(shù)明顯下降15.43%(P<0.01)。

表2 小鼠肝臟指數(shù)的變化

2.3 小鼠血清ALT活性和肝勻漿MDA的變化

如表3所示，與CON組比較，MOD組小鼠ALT和MDA活性均明顯升高，分別升高了209.91%(P<0.01)、83.65%(P<0.05)。與MOD組相比，GA組的ALT和MDA活性均明顯降低，分別降低了79.41%(P<0.05)、46.58%(P<0.05)。

表3 小鼠肝勻漿MDA的變化

2.4 小鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化

如表4和5所示，與CON組比較，MOD組小鼠BV/TV、Tb.N、DA、Conn.D、BMD明顯降低，分別降低了46.15%(P<0.01)、56.52%(P<0.01)、23.61%(P<0.01)、72.23%(P<0.01)、56.62%(P<0.05)；Tb.Sp、SMI明顯增加，分別增加了216.67%(P<0.05)、49.28%(P<0.01)。與MOD組相比，GA組小鼠BMD明顯增加，增加了102.58%(P<0.01)。

表4 小鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化

表5 各組小鼠Micro CT參數(shù)的變化

2.5 小鼠脛骨Micro CT三維圖的變化

與CON組比較，MOD組小鼠骨小梁數(shù)目減少、斷裂、變短，中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)很大的空腔。與MOD組相比，GA組小鼠骨小梁數(shù)目增多，骨小梁鏈接較為緊密，而且出現(xiàn)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較為明顯，骨微觀結(jié)構(gòu)保持完整。見圖1。

(注：CON為對(duì)照組，MOD為模型組，GA為甘草次酸組。SEG圖反映骨小梁的數(shù)量)圖1 小鼠脛骨Micro CT三維SEG圖

3 討論

四氯化碳經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝可引起細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜，致使肝細(xì)胞變性壞死[18]。因肝細(xì)胞受損導(dǎo)致血清中ALT和AST的活性顯著升高；而MDA含量可反映肝損傷的嚴(yán)重程度[19]。本實(shí)驗(yàn)中，與CON組比較，MOD組小鼠肝臟指數(shù)、ALT和MDA活性明顯增加，說明四氯化碳可造成小鼠肝損傷。與MOD組相比，GA組小鼠肝臟指數(shù)、ALT和MDA活性明顯下降，提示四氯化碳可致肝損傷，血液中ALT含量增加，引發(fā)體內(nèi)MDA含量的提高，經(jīng)甘草次酸給藥，對(duì)肝臟有一定程度的保護(hù)作用，血液中ALT與肝臟中MDA含量減少。甘草次酸可能減少M(fèi)DA含量，可增強(qiáng)內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的功能，防止或減輕肝臟的損傷，從而發(fā)揮保護(hù)作用[9]。

Micro CT掃描可較大程度克服骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量方面存在的問題，成為研究骨微觀結(jié)構(gòu)的新技術(shù)，是研究骨形態(tài)學(xué)的理想工具[20]。本實(shí)驗(yàn)中，與CON組比較，MOD組小鼠脛骨BV/TV、Tb.N、DA、Conn.D、BMD明顯降低，Tb.Sp、SMI明顯增加；三維圖顯示骨小梁數(shù)目減少變短、斷裂，中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)很大的空腔，說明腹腔注射四氯化碳可造成小鼠出現(xiàn)骨量丟失嚴(yán)重，且骨微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重被破壞。可能是肝受損后不能合成影響體內(nèi)激素、細(xì)胞因子和有毒物質(zhì)的相關(guān)蛋白或是細(xì)胞因子，從而影響骨代謝[16]。而與MOD組相比，GA組小鼠脛骨BMD明顯增加，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D數(shù)值上均有增加；Tb.Sp、DA、SMI數(shù)值上均有減少，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三維圖顯示骨小梁數(shù)目增加，骨小梁緊密連接，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較較明顯，保持較完整的骨微觀結(jié)構(gòu)。甘草次酸有很強(qiáng)清除-OH及O2-自由基的作用，可能通過氧化應(yīng)激途徑緩解四氯化碳致小鼠骨丟失[21]，另外甘草次酸具有雌激素樣作用，且其雌激素樣作用可能是ER介導(dǎo)產(chǎn)生的[22]，具體機(jī)制有待下一步研究。