凌佼佼，欒 蘭，楊 芳，陸 璐，洪 斌

(十堰市人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院)眼科，湖北 十堰442000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致成人失明的主要原因之一[1]。近年來(lái),隨著生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)改變等，糖尿病的發(fā)病率不斷升高，DR的發(fā)生率也隨之升高。流行病學(xué)資料顯示，我國(guó)DR的發(fā)病率為23.0%～43.0%，其中4.4%～8.2%的患者存在不同程度的視力受損，而因該病失明的患者每年高達(dá)1.2～2.4萬(wàn)例[2]。DR給患者的生活、工作造成了嚴(yán)重不良影響。DR一般包括非增生期和增生期2個(gè)階段，非增生期視網(wǎng)膜以微動(dòng)脈瘤出血、視網(wǎng)膜滲漏、相關(guān)神經(jīng)細(xì)胞改變等為特征，增生期則以新生血管形成為主要特征。在治療方面，目前臨床上主要采用控制血糖、激光光凝、給予糖皮質(zhì)激素、玻璃體切割術(shù)及神經(jīng)保護(hù)等手段進(jìn)行治療[3]，取得了一定的治療效果。但由于DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，上述治療無(wú)法完全控制病情進(jìn)展，且毒副作用也較明顯，因此，亟需尋找更為安全有效的藥物防治DR。葛花總黃酮為中藥葛花中提取的黃酮成分，楊芳等[4]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其能改善DR小鼠視網(wǎng)膜的病理形態(tài)，保護(hù)視網(wǎng)膜。但類似研究仍然較少，本研究主要探討葛花總黃酮對(duì)DR小鼠玻璃體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及高遷移率族蛋白B1(HMGB1)信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠90只，周齡6周，體重20～24 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2014-0011，飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用許可證為SYXK(鄂)2016—0031。將小鼠置于塑料鼠盒內(nèi)進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，每盒5只。鼠舍內(nèi)溫度保持在(21±2)℃，相對(duì)濕度控制在(55±5)%，光照周期為12/12 h，噪音<60 dB，氨濃度<20 ppm，每小時(shí)換氣8～20次，飼以滅菌的普通標(biāo)準(zhǔn)飼料及過(guò)濾水，保證食水充足，每周1次更換墊料、消毒。

1.1.2 主要藥品與試劑：鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，CAS號(hào)為18883-66-4，純度為≥98% (HPLC)，規(guī)格為每瓶100 mg，貨號(hào)為S8050，購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；使用時(shí)采用檸檬酸緩沖液(pH=4.2)溶解配制成6 mg/ml的STZ溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。葛花藥材，批號(hào)為170608，購(gòu)自廣東元德中藥飲片有限公司；采用超聲提取的方法提取藥材中葛花總黃酮，使用時(shí)用二甲基亞砜(DMSO)溶解，0.9%氯化鈉溶液稀釋配制成質(zhì)量濃度為5、10及20 mg/ml的葛花總黃酮溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。羥苯磺酸鈣片，規(guī)格為每片0.5 g，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20030087，批號(hào)為20170724，購(gòu)自南京長(zhǎng)澳制藥有限公司；使用時(shí)研碎成末，用DMSO溶解，0.9%氯化鈉溶液稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/ml的羥苯磺酸鈣溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。5%BSA封閉液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、含0.05% 吐溫20的中性PBS(PBST)及TBST緩沖液均購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。小鼠抗CD31單克隆抗體、小鼠抗HMGB1、肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠二抗及過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自佰思諾(天津)生物科技有限公司。甘油明膠封片液購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司。小鼠VEGF、核因子κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海億言生物科技有限公司。二奎琳甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、電泳緩沖液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司?；瘜W(xué)發(fā)光增強(qiáng)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備：LABOSPECT 008 AS型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；APE ELITE型全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)(德國(guó)DAS公司)；ROTOFIX32 A型離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)；DMi8型熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；SE300miniVE型電泳儀(美國(guó)Hoefer公司)；ChemiDoc MP型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及實(shí)驗(yàn)方法：適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將所有小鼠編號(hào)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組15只及造模組75只。造模組小鼠腹腔注射6 mg/ml的STZ溶液0.1 ml/10 g，1日1次，連續(xù)注射3 d；正常對(duì)照組小鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液(pH=4.2)0.1 ml/10 g，1日1次，連續(xù)注射3 d。1周后禁食不禁水12 h，測(cè)定小鼠空腹血糖，若血糖>13.9 mmol/L即為糖尿病模型建立成功；繼續(xù)喂養(yǎng)10周，視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)a、b波振幅下降，即為DR模型建立成功；此過(guò)程中意外死亡或造模失敗的小鼠及時(shí)補(bǔ)齊[5]。造模成功的小鼠依據(jù)血糖水平均勻分組，分為模型組、羥苯磺酸鈣組及葛花總黃酮低、中及高劑量組，每組15只。模型組及正常對(duì)照組小鼠分別經(jīng)口灌胃給予0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/10 g，1日1次；羥苯磺酸鈣組灌胃給予0.1 g/ml的羥苯磺酸鈣溶液0.1 ml/10 g，1日1次；葛花總黃酮低、中及高劑量組分別經(jīng)口灌胃給予5、10及20 mg/ml的葛花總黃酮溶液0.1 ml/10 g，1日1次。各組小鼠均連續(xù)給藥10周。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理：末次給藥后次日24 h禁食水，采用戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血2 ml，3 000 r/min速度離心5 min，分離得到的血清保存于-20 ℃冰箱備檢；處死小鼠，迅速摘取雙側(cè)眼球，右側(cè)眼球沿角膜緣環(huán)形剪開(kāi)，棄去晶狀體、房水，采用注射器吸取玻璃體0.3 ml，加入無(wú)菌PBS混勻，4 ℃條件下以12 000 r/min速度離心10 min，獲得的上清液凍存于-80 ℃冰箱備檢；之后去除玻璃體，完整剝離視網(wǎng)膜，置于液氮內(nèi)速凍，保存在-80 ℃冰箱用于后續(xù)蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)；左側(cè)眼球置于4 ℃的4%多聚甲醛內(nèi)固定，用于后續(xù)免疫熒光染色檢測(cè)[6]。

1.2.3 血糖水平測(cè)定：測(cè)定空腹血糖水平，取出“1.2.2”中制備玻璃體上清液，迅速恢復(fù)至室溫(25 ℃)，采用LABOSPECT 008 AS型全自動(dòng)生化分析儀，通過(guò)葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖水平。

1.2.4 免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜血管密度：“1.2.2”中的左側(cè)眼球在4%多聚甲醛內(nèi)固定16 h→去除玻璃體及晶狀體，完整剝離視網(wǎng)膜→PBS洗滌2 min×2 次→常溫下，置于5%BSA封閉液內(nèi)封閉2 h→4 ℃條件下，視網(wǎng)膜置于CD31抗體工作液(1∶100稀釋)內(nèi)孵育2 d→PBST洗滌15 min×6次→室溫下，視網(wǎng)膜置于FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作液(1∶100稀釋)內(nèi)，避光搖床孵育2 h→PBST洗滌15 min×6次→視網(wǎng)膜平鋪于載玻片上，剪成4瓣→甘油明膠封片液封片→滴加抗熒光猝滅劑，加蓋蓋玻片→晾干；在熒光顯微鏡下觀察、拍照，并計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜血管密度[7]。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)玻璃體VEGF、NF-κB及TNF-α水平：取出“1.2.2”中制備玻璃體上清液，迅速恢復(fù)至室溫，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用APE ELITE型全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)測(cè)定玻璃體VEGF、NF-κB及TNF-α水平[7]。

1.2.6 Western Blot法測(cè)定視網(wǎng)膜HMGB1蛋白表達(dá)水平：取出“1.2.2”中凍存的視網(wǎng)膜→液氮內(nèi)研磨粉碎→4 ℃條件下，加入細(xì)胞裂解液150 μl+蛋白酶抑制劑10 μl，反應(yīng)15 min→采用超聲破碎組織5 min→12 000 r/min速度離心10 min，取上清液→用BCA法蛋白定量試劑盒測(cè)定樣本蛋白含量→配制SDS-PAGE凝膠及電泳緩沖液，將分離膠和濃縮膠灌注浸進(jìn)入電泳儀內(nèi)→取蛋白樣品80 μg與5×上緩沖液混勻→煮沸10 min使蛋白變性，上樣→電泳，條件為濃縮膠60 V、3 h，分離膠120 V，至溴酚蘭跑至分離膠最底部→將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上→TBST緩沖液洗滌3 min→封閉液室溫封閉2 h→4 ℃條件下，分別置于HMGB1、β-actin抗體工作液(1∶100稀釋)內(nèi)孵育過(guò)夜→TBST緩沖液洗滌15 min×4次→37 ℃條件下，置于過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作液(1∶1 000稀釋)內(nèi)孵育2 h→TBST緩沖液洗滌15 min×4次→在暗室內(nèi)，用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影、定影→清水沖洗，晾干；采用ChemiDoc MP型凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片并拍照，之后采用Quantity One軟件分析各蛋白條帶光密度(OD)，計(jì)算HMGB1蛋白與內(nèi)參β-actin OD值的比值，分析HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 六組小鼠治療前后血糖水平比較

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血糖水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，葛花總黃酮低、中及高劑量組和羥苯磺酸鈣組小鼠血糖水平明顯降低，且葛花總黃酮低劑量組>葛花總黃酮中劑量組>葛花總黃酮高劑量組和羥苯磺酸鈣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 六組小鼠治療前后血糖水平比較Tab 1 Comparison of blood glucose levels among six groups of mice before and after treatment

2.2 六組小鼠視網(wǎng)膜血管密度比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜血管密度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，葛花總黃酮低、中及高劑量組和羥苯磺酸鈣組小鼠視網(wǎng)膜血管密度明顯降低，且葛花總黃酮低劑量組>葛花總黃酮中劑量組>葛花總黃酮高劑量組和羥苯磺酸鈣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 六組小鼠視網(wǎng)膜血管密度比較Tab 2 Comparison of retinal vascular density among

A.對(duì)照組；B.模型組；C.葛花總黃酮低劑量組；D.葛花總黃酮中劑量組；E.葛花總黃酮高劑量組；F.羥苯磺酸鈣組A. control group; B. model group; C. total flavonoids extracted from puerariae flos low-concentration group; D. total flavonoids extracted from puerariae flos medium-concentration group; E. total flavonoids extracted from puerariae flos high-concentration group; F. calcium dobesilate group圖1 六組小鼠視網(wǎng)膜血管免疫熒光染色結(jié)果(×100)Fig 1 Immunofluorescence staining of retinal vessels in six groups (×100)

2.3 六組小鼠玻璃體VEGF、NF-κB及TNF-α水平比較

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠玻璃體VEGF、NF-κB及TNF-α水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，葛花總黃酮低、中及高劑量組和羥苯磺酸鈣組小鼠玻璃體VEGF、NF-κB及TNF-α水平明顯降低，且葛花總黃酮低劑量組>葛花總黃酮中劑量組>葛花總黃酮高劑量組和羥苯磺酸鈣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 六組小鼠玻璃體VEGF、NF-κB及TNF-α水平比較Tab 3 Comparison of vitreous VEGF, NF-κB and TNF-α levels among six groups

2.4 六組小鼠視網(wǎng)膜HMGB1蛋白表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜血管密度水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，葛花總黃酮低、中及高劑量組和羥苯磺酸鈣組小鼠視網(wǎng)膜血管密度明顯降低，且葛花總黃酮低劑量組>葛花總黃酮中劑量組>葛花總黃酮高劑量組和羥苯磺酸鈣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖2。

表4 六組小鼠視網(wǎng)膜HMGB1蛋白表達(dá)水平比較Tab 4 Comparison of HMGB1 protein expression levels

3 討論

DR主要表現(xiàn)為黃斑水腫、視網(wǎng)膜新生血管生成[9]，其是目前全球范圍內(nèi)致盲的主要原因之一，近年來(lái)發(fā)病率日益升高，引起醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。DR的發(fā)生受到年齡、糖尿病病程、血糖水平、血脂水平、總膽固醇水平和尿微量蛋白等多種危險(xiǎn)因素的共同影響[10]。DR的發(fā)病機(jī)制未完全明確，張思琴等[11]的研究結(jié)果認(rèn)為，該過(guò)程可以涉及到多元醇通路活躍、二酰甘油-蛋白激酶C通路活化、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1及VEGF等生長(zhǎng)因子釋放、非酶糖基化終末產(chǎn)物累積及氧化應(yīng)激損傷等各種途徑，其中VEGF等生長(zhǎng)因子與新生血管形成有關(guān)，是目前研究的熱點(diǎn)。對(duì)于DR，臨床上尚未有特效藥物，而中醫(yī)從整體出發(fā)，有豐富的治療手段，許多中醫(yī)藥在DR的治療方面取得了較好的效果，對(duì)于DR新型治療藥物的研究有重要意義[12]。

A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.葛花總黃酮低劑量組；D.葛花總黃酮中劑量組；E.葛花總黃酮高劑量組；F.羥苯磺酸鈣組A. control group; B. model group; C. total flavonoids extracted from puerariae flos low-concentration group; D. total flavonoids extracted from puerariae flos medium-concentration group; E. total flavonoids extracted from puerariae flos high-concentration group; F. calcium dobesilate group圖2 Western-blot法檢測(cè)六組小鼠視網(wǎng)膜HMGB1蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 2 Results of HMGB1 protein expression of six groups by Western-blot method

葛花總黃酮是提取自葛花中的黃酮類化合物，藥理研究結(jié)果顯示，其具有解酒護(hù)肝、調(diào)節(jié)血糖血脂、抗腫瘤、胃黏膜保護(hù)、抗過(guò)敏、抗幽門螺桿菌、抗氧化應(yīng)激及細(xì)胞保護(hù)等多種作用[13]。在DR的治療方面，艾明等[14]已經(jīng)用不同劑量的葛花總黃酮對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)葛花總黃酮能通過(guò)提高視網(wǎng)膜抗氧化能力、減輕氧化損傷來(lái)保護(hù)DR小鼠視網(wǎng)膜。本研究采用STZ注射法成功建立了小鼠DR模型，之后采用不同濃度的葛花總黃酮進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，各用藥組小鼠血糖水平較低，且葛花總黃酮低劑量組>葛花總黃酮中劑量組>葛花總黃酮高劑量組和羥苯磺酸鈣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？崭寡巧呤荄R發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，控制血糖是逆轉(zhuǎn)早期非增生性視網(wǎng)膜損傷、晚期防止病情進(jìn)一步進(jìn)展的主要手段[15]。本研究結(jié)果表明，葛花總黃酮具有較好的血糖控制作用，且藥物濃度越高，降糖效果越好。

視網(wǎng)膜病理性血管增生是增殖期DR的主要特征，新生血管可生長(zhǎng)伸入玻璃體腔內(nèi)，破壞視網(wǎng)膜屏障，引起玻璃體出血，視網(wǎng)膜被牽引可最終出現(xiàn)失明[15]。抑制血管增生是改善病情的關(guān)鍵。本研究采用免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜新生血管變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，各用藥組小鼠視網(wǎng)膜血管密度均較低，且葛花總黃酮高劑量組和羥苯磺酸鈣組最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明高濃度的葛花總黃酮能有效抑制DR小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成，治療效果確切。

HMGB1屬于一種染色質(zhì)非組蛋白核蛋白，在所有真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均有分布，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程，在多種疾病的新生血管生成和組織細(xì)胞凋亡中起到重要作用。有研究結(jié)果顯示，HMGB1在DR患者視網(wǎng)膜及玻璃體液中表達(dá)上調(diào)，能主導(dǎo)血管生成及炎癥反應(yīng)[16]。HMGB1上調(diào)能促進(jìn)VEGF、NF-κB及TNF-α表達(dá)。VEGF為血管內(nèi)皮強(qiáng)效特異性刺激因子，能夠與細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，加速血管形成，同時(shí)能增加視網(wǎng)膜毛細(xì)血管通透性，誘發(fā)視網(wǎng)膜出血、滲出，是導(dǎo)致DR微血管病變的關(guān)鍵因素之一[17]。NF-κB 和TNF-α均為炎癥反應(yīng)相關(guān)因子，HMGB1能夠通過(guò)晚期糖基化終產(chǎn)物受體和Toll樣受體2種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)NF-κB表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α合成、分泌，誘發(fā)和放大炎癥反應(yīng)，一方面直接損傷視網(wǎng)膜，另一方面也可以刺激VEGF等因子釋放，加速血管增殖[18]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，各用藥組小鼠玻璃體VEGF、NF-κB及TNF-α水平較低，視網(wǎng)膜HMGB1蛋白表達(dá)水平較低，且葛花總黃酮高劑量組和羥苯磺酸鈣組最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明葛花總黃酮能下調(diào)HMGB1蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制HMGB1通路血管生成及炎癥反應(yīng)相關(guān)因子VEGF、NF-κB及TNF-α表達(dá)，這可能是葛花總黃酮減輕DR小鼠視網(wǎng)膜血管增殖的作用機(jī)制之一。

綜上所述，葛花總黃酮能降低糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠血糖水平，抑制視網(wǎng)膜血管異常增殖，降低玻璃體VEGF、NF-κB及TNF-α水平，呈劑量依賴性，其作用可能與抑制HMGB1信號(hào)通路活性有關(guān)。