黃巧 翟思佳 廖行偉 劉宇超 尹時(shí)華

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧530007)

MD是以反復(fù)發(fā)作性眩暈、波動(dòng)性聽(tīng)力下降為臨床特征，伴有耳鳴和耳脹滿感的內(nèi)耳疾病。它的基本病理表現(xiàn)為內(nèi)淋巴積水，與內(nèi)淋巴分泌和重吸收失衡有關(guān)。隨著生物信息學(xué)發(fā)展，越來(lái)越多學(xué)者研究疾病與多個(gè)基因間的聯(lián)系。MD的基因?qū)W研究也逐漸深入，孫瑩基于RNA-seq技術(shù)研究表明，免疫因素可能影響梅尼埃病的發(fā)病過(guò)程[1]。本研究檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中MD患者相關(guān)基因表達(dá)譜，鑒定差異基因及分析差異基因的功能及信號(hào)通路，探索MD的發(fā)病機(jī)制，并通過(guò)cMAP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選潛在治療MD的小分子化合物，為深入研究MD的治療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以“Meniere's disease”為檢索詞，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，獲得GSE109558數(shù)據(jù)集。

1.2 方法

利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析工具GEO2R，根據(jù)差異基因的條件：P＜0.05，|LogFC|≥1.5篩選差異表達(dá)基因。將差異表達(dá)基因上傳至DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行在線分析基因本體(Gene Ontology,GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PPI數(shù)據(jù)，并利用Cytoscape3.7軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作圖構(gòu)建及可視化分析。最后應(yīng)用cMAP數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)P＜0.05且|富集分?jǐn)?shù)|＞0.9篩選可能為治療MD的潛在小分子藥物。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因

根據(jù)差異基因的條件，獲得差異基因53個(gè)，其中上調(diào)基因22個(gè)，下調(diào)基因31個(gè)。

2.2 富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因富集分析，結(jié)果顯示GO分析富集在防御對(duì)病毒的反應(yīng)、對(duì)病毒的反應(yīng)、成肌細(xì)胞融合的負(fù)調(diào)節(jié)、蛋白水解、防御反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)拆解、骨吸收的積極調(diào)節(jié)、骨骼肌組織再生、趨化、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、MHC II類(lèi)蛋白結(jié)合、MHC II類(lèi)蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等生物過(guò)程，細(xì)胞定位在胞外（如表1）。KEGG顯著富集在Influenza A（如圖1）和Herpes simplex infection兩個(gè)途徑（如圖2）。

表1 GO分析Table 1 GO analysis

圖1 Influenza A信號(hào)傳導(dǎo)通路示意圖（標(biāo)注五星的位置為本研究中蛋白）Fig.1 Schematic map of the Influenza A(the location of the five stars is the protein in this study)

圖2 Herpes simplex infection信號(hào)傳導(dǎo)通路示意圖（標(biāo)注五星的位置為本研究中蛋白）Fig.2 Schematic map of the Herpes simplex infection(the location of the five stars is the protein in this study)

2.3 PPI分析

從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取得分≥0.4的PPI數(shù)據(jù)，利用Cytoscape3.7可視化分析顯示，該網(wǎng)絡(luò)由21個(gè)節(jié)點(diǎn)和35個(gè)邊緣組成（如圖3）。用插件CentiScaPe計(jì)算節(jié)點(diǎn)度，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度≥5獲得8個(gè)關(guān)鍵基因，分別為CXCL10（CXC 趨化因子配體 10）、IFI44L、POTEE（POTE錨蛋白結(jié)構(gòu)域家族成員E）、IFI44（干擾素誘導(dǎo)蛋白44）、XAF1（X染色體連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1）、OAS2（2′,5′-寡聚腺苷酸合成酶）、HERC5（HECT類(lèi)E3連接酶5）、EIF2AK2（蛋白激酶PKR）（如表2）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析（紅色節(jié)點(diǎn)代表上調(diào)差異基因，綠色節(jié)點(diǎn)代表下調(diào)差異基因；節(jié)點(diǎn)大小與節(jié)點(diǎn)度正相關(guān)，節(jié)點(diǎn)度越大節(jié)點(diǎn)的形狀越大。）Fig.3 The PPI network analysis(Red nodes correspond to upregulated genes and green nodes correspond to down-regulated genes.Node size is positively correlated with node degree,the higher the degree value,the bigger the node size is.)

表2 8個(gè)關(guān)鍵基因Table 2 The eight key genes

2.4 藥物篩選

將53個(gè)差異表達(dá)基因映射到cMAP數(shù)據(jù)庫(kù)，總共獲得33個(gè)相關(guān)小分子藥物，根據(jù)enrichment篩選出前10個(gè)負(fù)性相關(guān)且P＜0.05的小分子藥物（如表3）。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，這十個(gè)小分子藥物的機(jī)理作用見(jiàn)表4。

3 討論

MD是常見(jiàn)的內(nèi)耳疾病，其病因復(fù)雜至今尚未明確。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MD的基因?qū)W及免疫學(xué)研究備受關(guān)注，許多基因被證實(shí)與MD有關(guān)，如人類(lèi)組織相容性白細(xì)胞抗原(HLA)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，部分MD患者的促炎細(xì)胞因子水平升高，并且可能具有自身炎癥性內(nèi)耳疾病，某些過(guò)敏原可能誘發(fā)內(nèi)淋巴積水[3]。內(nèi)淋巴囊具有免疫調(diào)節(jié)功能，梅尼埃病的機(jī)制可能與免疫反應(yīng)引起的內(nèi)淋巴分泌和重吸收失衡有關(guān)，且臨床上免疫抑制劑治療梅尼埃病具有良好效果，因此，免疫因素可能是梅尼埃病的病因之一[4]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法從MD患者外周單核細(xì)胞篩選出的8個(gè)核心基因多與免疫學(xué)相關(guān)，其中CXCL10、IFI44L、IFI44、XAF1、OAS2、HERC5、EIF2AK2為上調(diào)基因，POTEE為下調(diào)基因。

表3 cMAP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的前10個(gè)小分子藥物Table 3 Top ten small molecule drugs screened from cMAP database

CXCL10為CXC家族趨化因子，是免疫學(xué)標(biāo)志物。研究表明CXCL10在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕血清中表達(dá)升高，且可能提示與疾病活動(dòng)有關(guān)[5,6]。IFI44L與IFI44為干擾素（IFN）I型誘導(dǎo)基因，參與IFN誘導(dǎo)的多種生物學(xué)功能，通過(guò)抑制病毒復(fù)制，激活自然殺傷細(xì)胞，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的產(chǎn)生和活化以及增強(qiáng)抗體反應(yīng)，在先天免疫中起重要作用[7]。XAF1為凋亡抑制蛋白（XIAP）的拮抗蛋白，它的表達(dá)水平與凋亡呈正相關(guān)，通過(guò)激活凋亡通路途徑促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，有望成為治療癌癥的理想基因靶標(biāo)。12號(hào)染色體上的寡聚腺苷酸合成酶（OAS）基因包含有3個(gè)基因（OAS1，OAS2，OAS3），編碼2'-5'OAS酶，在對(duì)病毒的先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[8]。ISG15是一種非?？焖僬T導(dǎo)的IFN刺激基因，HERC5是ISG15的主要E3酶，已被證明具有抗甲型流感病毒的抗病毒活性，其能通過(guò)泛素化反應(yīng)清除細(xì)胞局部無(wú)效蛋白分子，促進(jìn)IFN效應(yīng)基因的表達(dá)[9]。EIF2AK2也稱蛋白激酶PKR，其廣泛調(diào)節(jié)炎性體激活，如Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥體，PKR失活將嚴(yán)重?fù)p害炎癥小體激活，因此可能通過(guò)該分子藥理學(xué)靶向治療炎癥[10]。本研究篩選出的上調(diào)核心基因多在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕中表達(dá)水平升高，且提示與疾病活動(dòng)有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，MD患者中系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病率升高，這提示MD可能與自身免疫性疾病相關(guān)。POTE被稱為癌抗原，在許多癌癥中表達(dá)，以及極少數(shù)正常組織如前列腺，卵巢和睪丸。到目前為止，POTEE確定為主要表達(dá)的POTE旁系同源物。Vekariya等[11]首次報(bào)告POTEE在免疫細(xì)胞中的表達(dá)，特別是在巨噬細(xì)胞中特異性表達(dá)，而不是在單核細(xì)胞或T細(xì)胞，且參與細(xì)胞存活，此外，在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)升高的POTEE還通過(guò)活化mTORC2表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞侵襲性。因此，本研究篩選出的8個(gè)核心基因可能通過(guò)免疫反應(yīng)在MD發(fā)病機(jī)制中起重要作用，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

通過(guò)對(duì)差異基因GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因富集在防御對(duì)病毒的反應(yīng)、對(duì)病毒的反應(yīng)、成肌細(xì)胞融合的負(fù)調(diào)節(jié)、蛋白水解、防御反應(yīng)、趨化、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、MHC II類(lèi)蛋白結(jié)合、MHC II類(lèi)蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等生物過(guò)程，細(xì)胞定位在胞外。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要Influenza A和Herpes simplex infection兩個(gè)途徑。與前期研究結(jié)果一致，眾多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程、信號(hào)通路都與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[1]，提示MD可能具有自身炎癥性內(nèi)耳疾病。

此外，本研究通過(guò)cMAP篩選出前十個(gè)關(guān)聯(lián)度最大的負(fù)性相關(guān)小分子藥物。賴諾普利為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，間接通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)靶向鹽皮質(zhì)激素受體（MR）。MR與GR在內(nèi)耳中均有表達(dá)。糖皮質(zhì)激素廣泛用于治療內(nèi)耳疾病，其不僅通過(guò)GR介導(dǎo)，還通過(guò)MR介導(dǎo)[12]。因此，賴諾普利有可能通過(guò)靶向MR調(diào)節(jié)鈉、鉀和其他離子的平衡達(dá)到治療MD的目的，目前尚未有研究該藥物用于治療內(nèi)耳疾病。異卡波肼單胺氧化酶A/B型抑制劑，用于抗抑郁。MD患者常受眩暈、耳鳴困擾，給患者造成極大的心理負(fù)擔(dān)，抗抑郁藥可作為其輔助治療。柚皮素為免疫調(diào)劑，不僅能提高抗腫瘤免疫反應(yīng)，還能緩解自身免疫疾病的過(guò)度活化狀態(tài)[13]。伏立諾他為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，臨床上已被用作抗癌藥物，并具有免疫抑制特性。使用免疫療法的MD患者眩暈發(fā)作的持續(xù)時(shí)間和頻率有所改善[3]，因此，使用免疫療法作為控制眩暈發(fā)作的治療計(jì)劃的一部分應(yīng)該被考慮到，柚皮素與伏立諾他將有可能用于MD的免疫治療。哌侖西平為選擇性抗膽堿能藥，乙酰膽堿是橄欖耳蝸傳出系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，為耳蝸毛細(xì)胞和感覺(jué)神經(jīng)元提供反饋，毒蕈堿受體拮抗劑可增強(qiáng)內(nèi)耳對(duì)噪聲誘導(dǎo)的聽(tīng)力損失的抵抗力。饒秀麗等[14]通過(guò)制造反復(fù)眩暈?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)毒蕈堿受體M2、M3亞型在前庭內(nèi)側(cè)核表達(dá)增加，而MD是否也存在毒蕈堿受體表達(dá)增加，抗膽堿藥是否能通過(guò)降低毒蕈堿受體表達(dá)改善MD病癥狀？炔諾酮有較強(qiáng)的孕激素作用，可以對(duì)抗雌激素，并增加雌激素的代謝。絕經(jīng)前后女性體內(nèi)的性激素分泌減少，導(dǎo)致出現(xiàn)植物神經(jīng)功能紊亂等問(wèn)題，在某種程度上影響著女性MD的發(fā)生與發(fā)展。激素替代療法可能在一定程度上可以減緩女性MD的臨床癥狀。阿司匹林為抗血小板凝集劑，臨床病例分析發(fā)現(xiàn)阿司匹林作為聯(lián)合用藥用于短暫性腦缺血發(fā)作性眩暈[15,16]和偏頭痛性眩暈[17,18]的治療，可減少眩暈發(fā)作程度及頻率，改善患者生活質(zhì)量。昂丹司瓊5-HT3受體拮抗劑，臨床上用于止吐，可用于MD發(fā)作時(shí)出現(xiàn)的惡心嘔吐。上述篩選的小分子藥物，如賴諾普利、柚皮素、伏立諾他等有可能成為MD的治療或者輔助藥物。

表4 選出的前十個(gè)小分子藥物的機(jī)理作用Table 4 The mechanism of top ten small molecule drugs

總之，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法得出MD可能與自身免疫性疾病相關(guān)，使用抗組胺藥或免疫療法應(yīng)該作為控制眩暈發(fā)作治療計(jì)劃的一部分，篩選出的基因可能成為梅尼埃病潛在生物標(biāo)記物，篩選的小分子藥物有可能成為MD的治療或者輔助藥物，為MD的病因?qū)W研究及治療提供依據(jù)，但仍需進(jìn)一步深入研究。