周亞軍，王楸穎，馬永強，陳 艷，王淑杰*

（1.吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022；2.吉林市市場監(jiān)督管理局，吉林 吉林 132000；3.吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院，吉林 長春 130022）

亞硝胺是一類含氮的化學物質(zhì)，是最重要的化學致癌物質(zhì)和四大食品污染物之一。亞硝胺的攝入會導致急性中毒、慢性中毒，嚴重時會有引發(fā)腫瘤和致癌的風險[1-3]。人體內(nèi)的亞硝胺主要通過外源性攝入和內(nèi)源性生成2 個途徑形成。其中外源性主要來源于加工食品自身存在的亞硝胺及其前體物質(zhì)，而內(nèi)源性主要是由于亞硝胺在體內(nèi)的合成[4]。亞硝胺的生成受眾多因素的影響，主要有烹飪方式、烹飪溫度、時間、脂肪含量、蛋白質(zhì)含量及變化和亞硝酸鹽用量等[5-6]。近年來，國外有學者研究探討氨基酸對肉制品中亞硝胺形成作用及其品質(zhì)影響，但國內(nèi)相關研究較少。蛋白質(zhì)氧化可以產(chǎn)生游離氨基酸和生物胺等亞硝胺的前體物質(zhì)。蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的易亞硝化游離氨基酸，如脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸等在微生物的作用下均可發(fā)生脫羧反應，繼續(xù)反應生成亞硝胺[7-8]。Warthesen等[9]認為甘氨酸、纈氨酸是形成N-亞硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）的前體氨基酸，L-丙氨酸可形成N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）；Cosson等[10]認為作為脫羧底物的游離氨基酸與生物胺的存在部分相關，在一定條件下，生物胺可以生成亞硝胺；Drabik等[11]認為賴氨酸是NDMA的前體物質(zhì)。此外，氨基酸對改善產(chǎn)品的品質(zhì)也有一定作用，賴氨酸、精氨酸和其他外源氨基酸能夠改善產(chǎn)品的風味，抑制脂肪氧化，提高產(chǎn)品的保水性、質(zhì)構和乳化能力[12-15]。

本研究將3 種常見氨基酸（精氨酸、丙氨酸、脯氨酸）和不同含量亞硝酸鈉加在西式熏煮火腿配料中，研究幾種氨基酸對制成西式熏煮火腿的質(zhì)構、色差、pH值、硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、水分和蒸煮損失等品質(zhì)及亞硝酸鹽殘留量、N-亞硝胺形成的影響規(guī)律，旨在為肉制品中N-亞硝胺的抑制和產(chǎn)品品質(zhì)的提高提供理論依據(jù)和借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬后腿肉購于長春市地利生鮮超市。

復合磷酸鹽 滕州市香凝生物工程有限公司；亞硝酸鈉（食品級） 杭州龍山化工有限公司；卡拉膠（食品級） 河南千志商貿(mào)有限公司；亞硝胺混合標準品（N D M A、N-亞硝基乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、NDEA、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基-二正丙胺（N-nitrosodi-npropylamine，NDPA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基嗎啡膽堿（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDpheA），均為色譜純）美國Sigma公司；二氯甲烷、甲醇（均為色譜純）山東禹王和天下新材料有限公司；精氨酸、脯氨酸、丙氨酸標準品（均為分析純） 北京北方偉業(yè)計量研究所；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、三氯甲烷（均為分析純） 北京化工廠；冰醋酸、乙二胺四乙酸、硫代巴比妥酸、無水硫酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

手動灌腸機 鑫騰峰五金公司；多管旋渦混合儀金壇區(qū)白塔金昌試驗儀器廠；TGL-16gR型臺式冷凍離心機 西隴化工股份有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 上?；菔郎噭┯邢薰荆籎C-WD-12型圓形水浴氮吹儀 青島聚創(chuàng)環(huán)保設備有限公司；WFS分光測色儀 上海儀電物理光學儀器有限公司；CT3質(zhì)構儀 美國Brookfie公司；RYX-DY-25-D-M-15煙熏爐嘉興瑞邦機械工程有限公司；MZS-小型實驗均質(zhì)機器江蘇無錫市永和輕化設備廠；G R 3 0真空滾揉機諸城市瑞洋機械有限公司；斬拌機 諸城市強大機械廠；XO-SM50超聲波-微波聯(lián)合裝置 南京儀器有限公司；5977A氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 西式熏煮火腿樣品制備

基本配方：豬精肉100 g，食鹽2.5 g，糖1 g，水28 g，復合磷酸鹽0.3 g，味精0.3 g，馬鈴薯淀粉3 g，卡拉膠0.6 g。

制備工藝流程：原料肉預處理→滾揉腌制→斬拌→灌腸→煮制→煙熏→冷卻。

工藝操作要點：

1）原料預處理：選新鮮的豬后腿肉修整，去皮、骨、結締組織、筋鍵、淋巴、脂肪，使其成為純精肉，10%用料理機絞成肉糜，90%切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肉丁，混合均勻，每個樣品質(zhì)量為100 g；2）腌制：按照基本配方配制腌制液。將肉放入腌制液中，順時針攪拌均勻，裝入滾揉袋中密封，滾揉后置于冰箱中4 ℃腌制48 h；3）滾揉：真空度0.04 MPa下滾揉4 h，滾揉10 min，間歇20 min；4）灌腸：將滾揉腌制混合好的肉餡用簡易手動灌腸機灌制，灌裝時要松緊適度，灌好的火腿應扎孔排氣；5）煮制：本實驗采用水煮的方法，水煮時將蒸煮鍋水溫控制在80 ℃煮制40 min；6）熏制：將煮好的火腿置于煙熏爐中75 ℃煙熏60 min，冷卻后制得實驗樣品，供后續(xù)實驗使用。

1.3.2 實驗設計

參照Drabik等[16]的方法。在亞硝酸鈉用量分別為0、150、480 mg/kg條件下，研究分別添加1 000 mg/kg精氨酸、丙氨酸和脯氨酸對西式熏煮火腿質(zhì)構、色差、pH值、TBARS值、水分含量、蒸煮損失、亞硝酸鹽殘留量和亞硝胺含量的影響。其中，空白組是指不加氨基酸和亞硝酸鈉樣品組。

1.3.3 質(zhì)構測定

通過CT3質(zhì)構儀進行測定。設置參數(shù)為：測試類型TPA，探頭TA-44，形變50%，觸發(fā)點荷載50 g，測試速度1 mm/s。每個樣本重復測定3 次，取平均值。

1.3.4 色差測定

通過測色儀進行測定。指標用L*（亮度）值，a*（紅度）值和b*（黃度）值表示。每個樣本重復測定3 次，取平均值。

1.3.5 pH值測定

依據(jù)GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》方法測定。

1.3.6 TBARS值測定

依據(jù)Du等[17]的方法測定。

1.3.7 水分含量測定

依據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法測定。

1.3.8 蒸煮損失計算

蒸煮損失按式（1）計算：

式中：W1為灌制后煮制前的火腿質(zhì)量/g；W2為熏制后冷卻到室溫的火腿質(zhì)量/g。

1.3.9 亞硝酸鹽殘留量

依據(jù)GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法測定。

1.3.10 N-亞硝胺含量測定

樣品處理：使用超聲溶劑萃取法，依據(jù)Yuan Yuan等[18]的方法，適當修改。將10 g切碎的樣品放入絞肉機中攪碎，放入100 mL燒杯中，加20 mL二氯甲烷。用超聲波細胞破碎器超聲提取15 min。再加入20 mL二氯甲烷重復提取15 min，以便完全收集揮發(fā)性亞硝胺。過濾后，用無水硫酸鈉吸水再過濾。隨后在40 ℃下使用氮吹儀將液體吹近干。加入1 mL甲醇，在多管渦旋混合儀中攪拌1 min使溶液復溶。最后，甲醇水溶液通過尼龍0.45 μm注射過濾器過濾，用于氣相色譜-質(zhì)譜分析。

使用GC-MS測定亞硝胺含量，質(zhì)譜儀配備惰性離子源和無分流進樣口。HP-INNOWax毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）用于優(yōu)化方法。氦氣載氣保持在1 mL/min的恒定流量。注射端口保持在250 ℃，并在無分流模式下使用，施加8.19 psi的壓力脈沖。氣相色譜烘箱溫度設定如下：起始溫度為60 ℃（保持3 min），以10 ℃/min的速度升至180 ℃，然后20 ℃/min升至240 ℃，保持7 min。電離在電子碰撞模式（70 eV）下進行。離子源和傳輸線的溫度分別為230 ℃和250 ℃。溶劑切割時間為4 min。為了確定每種分析物的保留時間，之前以掃描模式在m/z 30～200范圍內(nèi)注射儲備溶液。然后在選定的離子監(jiān)測模式下，使用目標離子和限定離子對分析物進行定量。為每種化合物選擇的離子為NDMA（74）、NMEA（88）、NDEA（102）、NPYR（100）、NDPA（130）、NPIP（114）、NMOR（116）和NDpheA（169）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有實驗重復進行3 次。

2 結果與分析

2.1 氨基酸對西式熏煮火腿質(zhì)構的影響

由表1可知，在不同亞硝酸鈉用量下，添加精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的產(chǎn)品硬度分別增加了5.00%～6.70%、1.84%～2.11%、1.20%～2.50%（P＜0.05），加精氨酸產(chǎn)品的硬度值大于其他氨基酸組；添加精氨酸、丙氨酸和脯氨酸使產(chǎn)品的內(nèi)聚性和膠著性分別提高了10.42%～46.15%、4.17%～34.62%、46.15%～72.97%；2.81%～6.47%、3.02%～7.19%、13.46%～30.94%（P＜0.05），且隨亞硝酸鈉用量的增加逐漸增大；氨基酸的加入顯著改變了產(chǎn)品的彈性（P＜0.05），其中添加精氨酸產(chǎn)品的彈性增加了2.36%～2.89%，添加丙氨酸產(chǎn)品的彈性減小了6.54%～16.67%，添加脯氨酸組產(chǎn)品的彈性減小了0.73%～9.70%。精氨酸和丙氨酸的添加分別使產(chǎn)品的咀嚼性增大了5.70%～27.37%、13.92%～14.89%（P＜0.05），但脯氨酸的加入對咀嚼性的影響不顯著（P＞0.05）。

表1 氨基酸對西式熏煮火腿質(zhì)構的影響Table 1 Effect of amino acids on texture of western-style smoked sausage

2.2 氨基酸對西式熏煮火腿色差的影響

表2 氨基酸對西式熏煮火腿色差的影響Table 2 Effect of amino acids on color of western-style smoked sausage

由表2可知，添加精氨酸和丙氨酸使產(chǎn)品的L*值分別降低了0.42%～1.20%、0.50%～1.05%（P＜0.05）。脯氨酸的加入對產(chǎn)品L*值的影響不顯著（P＞0.05）。精氨酸和丙氨酸的添加使產(chǎn)品的a*值分別增加了6.73%～11.74%、6.99%～13.32%（P＜0.05），但脯氨酸對a*值的影響不顯著（P＞0.05），且隨著亞硝酸鈉用量的增加a*值逐漸增大。精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的加入對產(chǎn)品b*值的影響不顯著（P＞0.05），且隨著亞硝酸鈉添加量的增加，產(chǎn)品的b*值逐漸減小。

2.3 氨基酸對西式熏煮火腿pH值的影響

圖1 氨基酸對西式熏煮火腿pH值的影響Fig. 1 Effect of amino acids on pH of western-style smoked sausage

由圖1可知，添加精氨酸、丙氨酸和脯氨酸分別使產(chǎn)品的pH值增大了8.55%～9.06%、1.90%～2.05%、3.39%～3.57%（P＜0.05），其中，加精氨酸產(chǎn)品的pH值最大，這可能是因為精氨酸是堿性氨基酸。隨著亞硝酸鈉用量的增加，pH值并無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 氨基酸對西式熏煮火腿TBARS值的影響

圖2 氨基酸對西式熏煮火腿TBARS值的影響Fig. 2 Effect of amino acids on TBARS value of western-style smoked sausage

由圖2可知，精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的加入分別使產(chǎn)品的TBARS值減小了1.95%～4.63%、5.57%～12.43%、2.35%～19.35%（P＜0.05），且隨著亞硝酸鈉用量的增加，產(chǎn)品的TBARS值顯著減?。≒＜0.05）。

2.5 氨基酸對西式熏煮火腿水分的影響

由圖3可知，與不添加氨基酸組相比，精氨酸的產(chǎn)品的水分增加了2.65%～3.29%（P＜0.05），而添加丙氨酸和脯氨酸組水分變化不顯著（P＞0.05）。

圖3 氨基酸對西式熏煮火腿水分的影響Fig. 3 Effect of amino acids on moisture of western-style smoked sausage

2.6 氨基酸對西式熏煮火腿蒸煮損失的影響

圖4 氨基酸對西式熏煮火腿蒸煮損失的影響Fig. 4 Effect of amino acids on cooking loss of western-style smoked sausage

由圖4可知，在亞硝酸鈉用量為0 mg/kg和150 mg/kg時，加氨基酸均可降低產(chǎn)品的蒸煮損失，但影響不顯著（P＞0.05），在亞硝酸鈉用量為480 mg/kg時，氨基酸的加入能夠顯著減少產(chǎn)品的蒸煮損失（P＜0.05），添加精氨酸、丙氨酸和脯氨酸的產(chǎn)品分別減少了6.07%、3.62%和5.11%，且添加精氨酸組的蒸煮損失最小。

2.7 氨基酸對西式熏煮火腿亞硝酸鹽殘留量的影響

圖5 氨基酸對西式熏煮火腿亞硝酸鹽殘留量的影響Fig. 5 Effect of amino acids on residual nitrite concentration of western-style smoked sausage

由圖5可知，在不添加亞硝酸鈉時，加氨基酸產(chǎn)品的亞硝酸鹽殘留量與不添加氨基酸組無顯著性差異（P＞0.05）。當亞硝酸鈉用量為150 mg/kg時，加精氨酸和丙氨酸分別使產(chǎn)品的亞硝酸鹽殘留量減少了28.72%和17.22%（P＜0.05）；亞銷酸鈉添加量為480 mg/kg時，精氨酸和丙氨酸處理組亞硝酸鹽殘留量分別減少9.71%和9.41%；而脯氨酸產(chǎn)品則高于不添加氨基酸組。

2.8 氨基酸對西式熏煮火腿N-亞硝胺的影響

圖6 不同處理組樣品的總離子流色譜圖Fig. 6 Total ion current chromatograms of N-nitrosamines in different treatment groups

表3 氨基酸對西式熏煮火腿-亞硝胺含量的影響Table 3 Effect of amino acids on -nitrosamine contents of western-style smoked sausage

由圖6、表3可知，在不添加亞硝酸鈉時，加氨基酸能夠增加產(chǎn)品的NDMA含量，其中精氨酸和丙氨酸與不添加氨基酸組相比，NDMA含量分別增加了31.66%和7.56%（P＜0.05）；當亞硝酸鈉用量為150 mg/kg和480 mg/kg時，添加氨基酸與不添加氨基酸組相比能夠顯著增加NDMA的含量（P＜0.05），其中精氨酸產(chǎn)生更高的NDMA含量。在不同亞硝酸鈉用量條件下，氨基酸的加入與不添加氨基酸組相比，均能顯著增加NDPA的含量（P＜0.05），當亞硝酸鈉用量為0 mg/kg和150 mg/kg時，不添加氨基酸組和添加丙氨酸組均未檢測到NPYR的存在，且添加脯氨酸組的NPYR含量顯著高于添加精氨酸組；當亞硝酸鈉含量為480 mg/kg時，均檢測到NPYR的存在，且添加精氨酸和脯氨酸組的NPYR含量顯著高于不添加氨基酸組（P＜0.05），而添加丙氨酸組的NPYR含量顯著低于不添加氨基酸組（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 西式熏煮火腿品質(zhì)的變化

精氨酸和脯氨酸屬于堿性氨基酸，能夠在一定程度上增大產(chǎn)品的pH值[13,19]，使肌原纖維蛋白遠離等電點，增大肌原纖維蛋白之間的靜電斥力，從而增加了與水分子結合的位點，使得產(chǎn)品的保水性得到改善。脯氨酸與精氨酸增大了產(chǎn)品的pH值，且均提高了產(chǎn)品的蒸煮得率[14,19-20]。Lei Zhen等[21]研究表明，當精氨酸濃度增加時，肌球蛋白溶液的pH值顯著增加。同時精氨酸的胍基能夠提高豬肉肌球蛋白的溶解性，有利于蛋白質(zhì)的溶出，增強乳化體系的穩(wěn)定性，形成致密穩(wěn)定的三維蛋白結構[22-24]。此外精氨酸的加入能夠增加肌球蛋白表面疏水殘基和活性巰基的含量[25]，從而進一步改善產(chǎn)品的質(zhì)地。Qin Hao等[26]研究表明，精氨酸的加入顯著增大了內(nèi)聚性、彈性和咀嚼性，這與本研究結果一致。氨基酸的加入在一定程度上具有抗氧化和發(fā)色的作用[27]，能夠抑制蛋白質(zhì)和脂肪的氧化，從而降低產(chǎn)品的TBARS值，這與Xu Peng[28]和Hes[29]等的研究結果一致。產(chǎn)品色差值的變化，可能是由于氨基酸的加入導致產(chǎn)品的pH值發(fā)生變化，從而改變了產(chǎn)品的保水性，水分含量增加，導致產(chǎn)品的L*值減小[30]，同時a*值在還原態(tài)肌紅蛋白狀態(tài)下為紅色，在氧化態(tài)肌紅蛋白下為棕色或褐色[31]，氨基酸的加入會抑制血紅蛋白氧化，增強血紅蛋白濃縮物穩(wěn)定性，從而產(chǎn)品具有更高的a*值，這與Zhou Cunliu等[32-33]的研究結果相一致。Ning Cheng等[12]研究表明，與不加亞硝酸鈉和氨基酸的香腸相比，僅添加0.01%亞硝酸鈉的香腸L*值下降，a*值顯著增大，b*值顯著降低。Zhou Cunliu等[19]研究表明，隨精氨酸添加量增加，豬肉腸的L*值持續(xù)下降（P＜0.05）。添加0.4%以上精氨酸顯著增大了產(chǎn)品的a*值，顯著降低了b*值，本研究結果一致。

3.2 西式熏煮火腿亞硝酸鹽殘留量和N-亞硝胺含量的變化

產(chǎn)品亞硝酸鹽殘留受氨基酸的影響，精氨酸和丙氨酸可與亞硝酸鈉反應，生成亞硝胺和其他物質(zhì)，同時亞硝酸鹽會與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的胺進行反應，生成亞硝胺，從而降低亞硝酸鹽殘留量[34]。Ning Cheng等[12]研究表明，加精氨酸后可顯著降低亞硝酸鈉處理后產(chǎn)品中亞硝酸鹽的殘留量，這與本研究結果一致。當亞硝酸鈉用量為0 mg/kg和150 mg/kg時，不添加氨基酸組和添加丙氨酸組均未檢測到NPYR的存在，這可能是由于丙氨酸不能促進NPYR的形成。在不同亞硝酸鈉用量條件下，不同氨基酸添加組的NDpheA含量均顯著低于不添加氨基酸組（P＜0.05），這可能是由于這3 種氨基酸的加入不利于NDpheA的形成。加氨基酸產(chǎn)品的亞硝胺總量顯著高于不添加氨基酸組，這可能是由于氨基酸的加入促進了亞硝胺的形成。Drabik等[11,16]研究表明，脯氨酸的加入不影響NDMA的形成，但對NPYR的形成有顯著影響，與亞硝酸鈉用量相比，脯氨酸對NPYR產(chǎn)量的影響較大，脯氨酸作為亞硝胺形成前體的重要性得到了證實。劉云等[35]研究表明，精氨酸提高了肉制品中NDMA的含量。Ender等[36]認為丙氨酸可以形成NDMA，與本實驗結論一致。

4 結 論

3 種氨基酸可作為品質(zhì)改良劑改善產(chǎn)品的質(zhì)構和色澤、保水性，減少產(chǎn)品的氧化；精氨酸和丙氨酸能降低西式熏煮火腿中亞硝酸鹽的殘留量，但3 種氨基酸的加入均增加了N-亞硝胺的總量。因此，3 種氨基酸可作為前體氨基酸，能在一定程度上促進N-亞硝胺的生成，在加工過程中應盡量避免添加這3 種氨基酸達到抑制N-亞硝胺形成的目的。本研究為N-亞硝胺形成機理深入研究以及肉制品品質(zhì)的提高提供理論依據(jù)。