肖 瑜，楊新標，林 楠，鄭明珠*，劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

大黃米（Panicum miliaceum L.），又稱軟黃米，是黍子脫殼后的產(chǎn)物。在美國、印度、日本和非洲等多個國家，大黃米的生產(chǎn)和加工都較為普遍，有的國家甚至將其作為主食，而我國大黃米加工產(chǎn)品缺乏，對大黃米的利用率遠不及國外。大黃米富含淀粉且具有豐富的蛋白、礦物質和維生素，含有較多的活性物質[1-2]。大黃米中淀粉的質量分數(shù)為70%左右[3]，而以淀粉為基礎的食品大多存在易于老化、貨架期短等問題，大黃米淀粉（proso millet starch，PMS）的老化嚴重影響其產(chǎn)品在貯藏過程中的品質。淀粉的老化是直鏈淀粉分子的纏繞、有序化和支鏈淀粉外側短鏈重結晶所引起[4]。淀粉老化可分為短期老化和長期老化，影響淀粉老化的原因有淀粉分子結構（直鏈淀粉和支鏈淀粉的比值）、淀粉中的水分含量和外源添加物質（蛋白質、脂肪、糖、多酚和鹽等）等。通常直鏈淀粉含量越高，老化程度越大，直鏈淀粉的老化可形成結晶核，且協(xié)助核結晶的增加[5]。與直鏈淀粉相反的是，支鏈淀粉含量越高，老化速度越慢，支鏈淀粉含量與長期老化有關[6]。由于淀粉的老化，保水能力下降，質地變硬，影響其產(chǎn)品的品質，造成食品浪費和經(jīng)濟損失[7]。

近年來，許多研究將外源添加物質如親水膠體[8]、脂質[9]、多糖[10]和多酚[11]添加到淀粉中，從而影響淀粉的老化。蛋白質在食品行業(yè)中應用越來越廣泛，在食品中添加適量的蛋白質不僅可改善食品的風味和口感，還可以提高食品的營養(yǎng)價值[12-14]。目前國內外研究主要集中在蛋白質的添加對淀粉理化性質及消化性影響方面。Xu Hui等[15]研究發(fā)現(xiàn)，用玉米醇溶蛋白（zein）微膠囊包埋淀粉顆粒，經(jīng)冷凍干燥和低溫噴霧干燥處理后微膠囊顆粒的慢消化淀粉、抗性淀粉含量顯著增加。另外有研究表明，在35 ℃的條件下將zein與玉米淀粉混合，zein中的α-螺旋結構增加，形成黏彈性系統(tǒng)，從而增加了zein-淀粉面團的延展性[16]。有研究發(fā)現(xiàn)糯性玉米淀粉和大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）之間相互作用比普通玉米淀粉和SPI之間作用對淀粉的理化性質影響更明顯[17]。并且，當?shù)鞍踪|存在于食品基質中可能會影響淀粉的消化率。Yang[18]和Ma Da[19]等研究發(fā)現(xiàn)，凝膠化是乳清蛋白的重要功能特性，已被廣泛用于改善食物的質地和味道，馬鈴薯和小麥淀粉可以增強乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）的凝膠化。

本實驗以PMS-zein、PMS-SPI和PMS-WPI混合物為研究對象，從熱特性、晶體結構、質構等方面研究添加外源蛋白質與PMS之間的相互作用對淀粉老化的影響，以期為提高糯性谷物淀粉及淀粉產(chǎn)品質量和附加值提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大黃米 遼寧建平縣惠豐源糧食加工有限公司；zein、SPI、WPI 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；高速離心機 上海安亭科學儀器廠；TA-XT Plus型物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA公司；VERTEX 70傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司；D/MAX2500 X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 日本理學公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海柏欣儀器設備廠。

1.3 方法

1.3.1 PMS提取

大黃米→磨粉→過篩（100 目）→堿液浸泡（0.075 mol/L NaOH）[20]→離心→刮去上層黃褐色軟層→淀粉粗漿→加水稀釋成淀粉乳→調節(jié)pH 7→離心（反復洗滌沉淀3 次）→淀粉精漿→干燥（40 ℃）→PMS（100 g大黃米粉可提取60 g淀粉，其中堿液浸泡可除去谷物中的脂質，分散基質蛋白質）。

zein（150 mg/mL）先分散于60%的乙醇溶液中，再緩慢加入PMS[22]；SPI（150 mg/mL）先分散于0.067 mol/L、pH 7.8的磷酸緩沖溶液中，再緩慢加入PMS[23]；WPI（100 mg/mL）先分散于蒸餾水中，磁力攪拌30 min，置于4 ℃條件下不斷攪拌過夜，調節(jié)pH 7，緩慢加入PMS[24]；將上述混合物置于90 ℃水浴攪拌30 min后，取出樣品冷凍干燥，即得PMS-zein、PMS-SPI和PMS-WPI混合物，研磨過80 目篩備用。

1.3.2 PMS理化指標測定

對PMS和混合物樣品進行XRD分析。采用銅靶Cu Kα，管壓40 kV，管流30 mA，掃描范圍2θ為5°～50°，掃描速度10°/min，步長0.02°[26]。測量結果采用MDI Jade 6.5軟件進行分析。

根據(jù)直鏈淀粉含量，大黃米可分為2 種類型：糯性（低直鏈淀粉含量）和非糯性（高直鏈淀粉含量）[3]。本實驗選用的是我國傳統(tǒng)特色大黃米糯性品種，由表1可知，PMS中的直鏈淀粉質量分數(shù)較低。

嘉興和紹興各有1處景觀得到康、乾二帝的偏愛，煙雨樓在避暑山莊中仿建，蘭亭在紫禁城、清漪園、圓明園、西苑和避暑山莊等多處皇家園林中仿建。

一是金融監(jiān)管法律體系的完善能創(chuàng)造有序整改環(huán)境，從而避免市場的順周期性波動風險。金融監(jiān)管法律法規(guī)的建立，能規(guī)范各類金融的資質，打擊各種不正當經(jīng)營行為，取締非法投資商，能為市場進入和退出創(chuàng)新一個好的投資環(huán)境。

人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染：HPV是通過性傳播感染的，有100多個亞型。對許多人來說，人乳頭狀瘤病毒不會對人造成傷害，多數(shù)不經(jīng)治療就可能消失。只有很小比例的HPV感染病人會患上口腔癌或口咽癌，與口腔癌和口咽癌相關的主要是16型。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是重要的豆科牧草，其環(huán)境適應能力強，粗蛋白含量豐富。紫花苜蓿內生細菌能夠不同程度地拮抗多種病原真菌，抑制尖孢鐮刀對紫花苜蓿造成的萎蔫作用，具有較強的生防效果[12-13]；有些內生細菌能夠產(chǎn)嗜鐵素、HCN、幾丁質酶和羧甲基纖維素酶等[14]；部分紫花苜蓿內生細菌和根際細菌也因其促生能力在生產(chǎn)中得到廣泛應用[15]。根瘤菌是有益的土壤細菌，能夠在土壤中與苜蓿共生結瘤固氮，也能夠在植物組織內定殖[16-18]。已有大量內生根瘤菌分離自紫花苜蓿的種子[19-20]、花、葉、莖和根[21-22]。

1.3.4 樣品凝膠質構特性的測定

1.3.5 傅里葉紅外光譜掃描

樣品（高為2 cm的圓柱體）的凝膠質構性質通過TA-XT物性檢測儀測定。參考物性儀質構分析（texture profile analysis，TPA）測定模式，采用圓柱形金屬探頭（P/0.5R，平底）。測試條件：測前速率1.0 mm/s；測試速率2.0 mm/s；測后速率2.0 mm/s；壓縮程度40%；2 次壓縮間隔為2 s，每個樣品做3 組平行實驗，得到質構參數(shù)曲線。通過Texture Expert Excede Version 1.0（Stable Micro Systems Software）軟件分析處理數(shù)據(jù)，得到硬度、黏附性、膠黏性和咀嚼性。

相較于其他教學模式,案例教學著重強調培養(yǎng)學生解決問題能力及創(chuàng)新能力,不再停留于獲取固定化原理知識或規(guī)律知識的階段,激發(fā)學生求知欲及學習熱情。除獲取課程知識外,案例教學能大大提高學生表達能力,樹立學生面臨困難解決困難的信心及決心,一定程度上縮小實踐與教學間差距,增強學生決策能力,真實反映學生職業(yè)行為能力的高低。同時,案例教學模式能充分激發(fā)學生學習主動性及積極性,給予更多學生對外展示自身能力的機會及平臺,有利于提高教師自身業(yè)務水平鍛煉其業(yè)務能力,實現(xiàn)教學雙方良好互動[4]。此外,由于案例教學仿真性、創(chuàng)造性及能動性較強,是強化學生理論聯(lián)系實際能力的有力手段。

參考Cai Jinwen等[25]方法并稍作修改。稱取1 mg樣品與100 mg溴化鉀充分混合研磨，在15 MPa下抽真空壓片1 min。扣除溴化鉀薄片的背景，于4 000～400 cm－1下掃描64 次，分辨率為4 cm－1，使用Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理，得到紅外光譜圖。

1.3.6 XRD分析

近日，據(jù)媒體報道，華潤置地首席執(zhí)行官吳向東確認加入華夏幸福。12月4日下午6點，華夏幸福發(fā)布公告稱，決定聘任俞建為公司聯(lián)席總裁，分管財務及融資等業(yè)務。吳向東曾經(jīng)的搭檔——華潤置地前CFO俞建已先吳向東一步就任。

準確稱取PMS及其混合物各20 g，加入80 mL蒸餾水攪拌混合后置于蒸鍋中加熱20 min，將糊化后的樣品置于4 ℃條件下貯存1、7、15 d。一部分用于質構特性的測定，另一部分凍干粉碎過100 目篩備用。

蛋白質含量測定參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》；水分含量測定參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；脂肪含量測定參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》；采用總淀粉試劑盒和直鏈淀粉/支鏈淀粉試劑盒（伴刀豆球蛋白A方法）[21]測定淀粉含量；灰分測定參考GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》。

1.3.7 熱特性分析

參考Wang Lili等[27]方法，稍作改動。準確稱取3 mg樣品置于DSC坩堝中，并加入10 μL去離子水，混合均勻后密封。將密封后的坩堝于室溫條件下平衡24 h，用空坩堝作參比。通入氮氣（氮氣流速50 mL/min），升溫速度10 ℃/min，由30 ℃升至130 ℃，得到起始溫度（To）、峰值溫度（Tp）、最終溫度（Tc）和老化焓值（ΔH）。每個樣品測定3 次平行。

Avrami方程被廣泛用于研究淀粉老化動力學[28-29]，方程表示如下：

公平公正的判卷是保證考核評價改革效果的重要環(huán)節(jié)。改革前，期末考試往往由任課教師一人進行判卷，系主任進行審核但并未深究評分的“寬嚴”程度。改革后，期末試卷實行系主任負責的教師集體閱卷模式，開展評卷質量的自評和互評，盡量減少評卷的隨意性，保證評分盡可能科學合理。

式中：R為樣品結晶率；Ht、H0和H∞分別為t、0、∞時間的焓變/（J/g）；k為結晶速率常數(shù)；n為Avrami參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和處理，采用Duncan法進行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著，數(shù)據(jù)以表示。

2 結果與分析

2.1 PMS的成分分析

表1 PMS成分分析結果Table 1 Composition of proso millet starch%

1.3.3 樣品的制備與處理

2.2 質構特性分析

表2 PMS-蛋白質混合物老化1、7、15 d的質構特性Table 2 Texture pro files of proso millet starch-protein mixtures stored for 1, 7 and 15 d

采用TPA測定不同蛋白對PMS的凝膠質構特性的影響，結果如表2所示。在4 ℃條件下貯存15 d，添加zein的PMS凝膠硬度從727.50 g降至688.67 g，SPI和WPI的添加顯著降低了PMS的硬度（P＜0.05），其硬度分別降至630.93 g和397.52 g。樣品凝膠的硬度隨著貯存時間的延長而增加，這與Singh等[30]研究結果一致。而隨著貯存時間的延長，樣品凝膠硬度逐漸增大，這主要是由于淀粉長期老化引起的，老化初期，直鏈淀粉在氫鍵的作用下，可形成具有一定韌性的淀粉凝膠網(wǎng)絡結構[31]，分子間的纏繞程度越強，其形成的網(wǎng)絡結構強度則越高，而支鏈淀粉的重結晶則進一步增強網(wǎng)絡結構的剛性。PMS含有較高的支鏈淀粉，支鏈淀粉外鏈長的淀粉容易老化。添加蛋白后，淀粉-蛋白體系的硬度降低表明在凝膠貯存的過程中蛋白質可降低淀粉的硬度，這可能是因為蛋白質會導致淀粉微相區(qū)濃度下降，抑制淀粉分子進行重排，從而延緩淀粉老化[32]。黏附性指淀粉凝膠黏附在其他物體上的能力，反映探頭測試樣品的黏著作用所消耗的功。添加蛋白質的PMS形成的凝膠比不添加蛋白質所形成的凝膠具有更高的黏附性，并且黏附性和貯存時間呈反比。樣品的膠著性和咀嚼性也隨著貯存時間的延長而增加，而添加不同蛋白質導致了不同的結果，這可能是由于3 種蛋白質之間的結構組成不一致，并且淀粉凝膠的機械性質亦取決于淀粉分子的結構。淀粉凝膠的質構特性是決定食品體系中淀粉性能的重要標準。綜上可知，添加WPI，隨著貯存時間的延長，體系的硬度增加最為緩慢，延緩PMS老化的效果最好。

2.3 傅里葉紅外光譜分析

淀粉在其分子內和分子間存在大量維系體系三維結構的氫鍵[33]。采用傅里葉紅外光譜對老化不同時間的樣品進行檢測，結果如圖1所示。

圖1 PMS-蛋白質混合體系的紅外光譜圖Fig. 1 FTIR spectra of proso millet starch-protein mixed systems stored for different periods

從圖1可以看出，樣品在3 500～3 200 cm－1處呈現(xiàn)的一個寬而強的吸收峰，這是多聚體分子間典型的締合羥基特征峰，說明淀粉分子間的晶體是通過氫鍵緊密相連的。PMS-zein體系是N—H鍵的收縮振動，PMS-SPI和PMS-WPI則是O—H鍵的收縮振動。添加不同蛋白質后，吸收峰往低波長方向移動，說明體系之間的氫鍵作用力在增強。在2 930 cm－1左右處的吸收峰為C—H鍵的振動吸收峰，這與淀粉中蛋白和脂肪含量相關[34]，由圖1可看出，淀粉-蛋白體系在2 930 cm－1處的吸收峰強于淀粉。PMS和淀粉-蛋白體系在1 650 cm－1處呈現(xiàn)強的特征吸收峰，是因為C＝O的彎曲振動，而不同于PMS，淀粉-蛋白體系在1 525 cm－1附近為蛋白特征吸收峰（酰胺II）[35]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，添加3 種蛋白質后未出現(xiàn)新的特征吸收峰，說明蛋白質的加入并未和淀粉形成新的基團，主要還是通過氫鍵作用力構成一個緊密纏繞的三維凝膠網(wǎng)絡結構。

臨上車之前，老婆接到了一個電話。電話依舊是姚琳琳打來的，是再次來電話勸老婆退票的。老婆說：雨辰病了這么久，都沒查出到底得的是啥病，不能再耽擱了，能早到哈爾濱一天是一天。你就放心吧，火車的安全系數(shù)高，應該不會有事兒的。姚琳琳說：你說的也是。那我就不勸你了，你自己路上多加小心吧。到了那邊兒，別心痛錢，有什么困難別忘了給我打電話。需要人手的話就讓我家裘子去，他干別的不行，跑個道兒，學個舌的還行。老婆就有點兒感動，感動得眼圈兒都紅了，說：琳琳，謝謝你了，真的謝謝你了。

由表2可以看出，在單門檻效應檢驗中，F(xiàn)統(tǒng)計量為20.792 8，Bootstrap計算得到的P值為0.000 0，表明在1%的顯著性水平下可以拒絕不存在門檻值的原假設，即存在一個門檻值。在雙門檻效應檢驗中，F(xiàn)統(tǒng)計量為13.361 4，P值為0.000 7，表明在1%的顯著性水平下拒絕存在1個門檻值的原假設，即存在兩個門檻值。在三門檻效應檢驗中，F(xiàn)統(tǒng)計量為3.368 6，P值為0.113 7，表明即使在10%的顯著性水平下也無法拒絕存在2個門檻值的原假設，因此，我們接受存在兩個門檻值的檢驗結果，到此結束對門檻效應的檢驗。

2.4 結晶結構分析

在4 ℃下貯存1、7、15 d后，對老化的樣品進行XRD分析，從而評價樣品的老化特性。淀粉因品種來源和結晶結果的差異而形成不同類型的XRD圖譜[36-37]。淀粉主要分為結晶型和非結晶型，而淀粉的結晶結構主要有A、B、C、V 4 種類型，A型主要存在谷物中，一般在15°、23°處有較強的單衍射峰，17°和18°處有較強的雙衍射峰。如圖2所示，老化1 d的樣品在17°左右出現(xiàn)較強衍射峰，這是典型的B型結晶結構。老化樣品呈現(xiàn)B型結晶結構可能是由于在加熱過程中部分顆粒結晶度消失，同時伴隨著聚合物和溶劑（脫水收縮）之間的剛性和相分離逐漸增加。老化樣品的峰接近17°，峰的形成是淀粉無定性區(qū)的熔融結晶的結果，主要可能是因為支鏈淀粉部分的重結晶，這也表明淀粉A型結晶結構15°的特征峰經(jīng)過糊化后被破壞[27]。加入不同蛋白質后XRD的峰強度減弱，一般的，XRD的峰強度表明了糊化后淀粉的老化程度[38]，衍射峰越高越窄，老化程度越強。本研究表明，加入蛋白后可抑制PMS的老化，這與TPA和DSC結果一致。

2.5 熱特性分析

表3 PMS-蛋白質混合物老化7 d和15 d的熱特性Table 3 Thermal properties of proso millet starch-protein mixtures stored for 7 and 15 d

如表3所示，貯存期間老化樣品的To、Tp和Tc變化不大，這與之前的研究一致[17,39]。Tp基本在50 ℃左右，屬于支鏈淀粉老化的解離峰[40]。如圖3所示，樣品老化1 d在30～130 ℃的升溫過程中并未從老化曲線觀察到老化焓，而樣品在貯存7 d和15 d再加熱的過程產(chǎn)生熱轉變，表明樣品在貯存的過程中發(fā)生老化。隨著貯存時間的延長，樣品的焓值逐漸增大，這表明在貯存期間支鏈淀粉結晶融化需要更多的能量[41]。貯存15 d之后PMS焓值變化從第7天的2.48 J/g升至3.51 J/g，含有蛋白質的PMS老化焓比PMS低，這可能是因為蛋白質的存在減少了淀粉的含量，因此蛋白質可以降低淀粉的老化。另一方面，PMS中的支鏈淀粉含量較大，而支鏈淀粉比直鏈淀粉更易重結晶，會呈現(xiàn)更高的老化焓。DSC結果顯示，WPI比zein和SPI對PMS老化的影響更大。結果表明在PMS中添加蛋白質可以抑制淀粉的老化，尤其是可以抑制支鏈淀粉的重結晶。

圖3 PMS-蛋白質混合體系的DSC圖譜Fig. 3 DSC of proso millet starch-protein mixed systems

2.6 結晶動力學分析

通過老化過程的模型化研究，可以掌握由老化引起的淀粉食品品質的變化規(guī)律，對食品品質的預測和控制有較大意義。淀粉回生焓值反映晶體的熔化，且其晶體熔化形成的吸熱峰是支鏈淀粉長期回生后再熔化引起的，而非直鏈淀粉[8]。淀粉在結晶過程中生成的結晶屬于天然高分子，Avrami方程描述了貯存期間焓的變化，因此采用Avrami模型描述淀粉回生過程，該模型可表達晶核成核方式和生長速率。

圖4 DSC檢測PMS-蛋白質混合體系老化Fig. 4 Retrogradation of proos millet starch-protein mixtures monitored by DSC

建立老化動力學模型研究3 種蛋白對PMS老化性質的影響，利用DSC測定4 ℃下保存不同時間樣品的老化焓，結果如圖4所示。隨著貯存時間的延長，所有樣品的老化焓增大，表明形成的結晶更多，需要更多的能量融化。將老化不同時間的老化焓代入式（1）中，得到樣品動力學方程及參數(shù)（表5）。

表5 PMS-蛋白質混合體系老化動力學模型（44 ℃）Table 5 Avrami models for retrogradation kinetics of proso millet starch-protein mixtures (4 ℃)

由表5可知，老化動力學數(shù)據(jù)符合Avrami方程（R2=0.985 7～0.997 4）。Avrami指數(shù)（n）反映了成核過程的晶體形態(tài)，n值越小，成核越快。由表5可知，PMS-蛋白質混合體系主要是以自發(fā)成核為主（1＜n≤2），其成核類型為接近于散發(fā)性核的棒狀生長方式[27,42]，這和XRD結果一致。加入蛋白質的PMS的n值均高于不含蛋白質的PMS，表明晶核在結晶開始形成時成核速度變慢。淀粉結晶速率常數(shù)（k）代表重結晶的速度，其可能受到支鏈淀粉的比值、溫度、pH值、淀粉顆粒大小分布和非淀粉組分的影響[43]。k值越大，結晶速率越快，加入蛋白質的樣品的k值比PMS的更低，表明加入蛋白后體系的重結晶增長速率降低，因此，蛋白質的存在影響了支鏈淀粉回生。3 種蛋白對PMS成核及結晶速率的影響程度不同，這可能是因為3 種蛋白的結構和分子質量不同，WPI對PMS的影響最大，其成核較慢，這是由于成核方式偏向于棒狀生長方式。不同分子質量的蛋白可能有助于淀粉和蛋白混合體系k值的差異。

3 結 論

研究了3 種不同蛋白質和PMS混合體系的質構特性、熱力學性質、結晶結構等，通過這些指標表征蛋白質對PMS老化的影響。研究結果發(fā)現(xiàn)zein、SPI和WPI以不同程度延緩PMS的老化。與PMS相比，PMS-蛋白質混合體系的硬度下降，質地變得較為柔軟，貯存期的穩(wěn)定性提高，表明改善了PMS的品質。紅外圖譜表明3 種蛋白質和PMS之間沒有形成新的特征峰，主要是通過氫鍵形成一個緊密纏繞的三維凝膠網(wǎng)絡結構。由于支鏈淀粉的重結晶或是因加熱而使部分結晶消失，老化后的樣品呈現(xiàn)典型的B型結構，XRD峰強度隨著貯存時間的延長而增加，而含有蛋白質的PMS峰強度弱于PMS，說明蛋白質可以延緩PMS的老化，這與TPA和DSC的結果一致。熱焓值隨著貯存時間的延長而增大，熱焓值的增加與支鏈淀粉的重結晶有關，同時，添加蛋白質后混合體系的熱焓值減小，說明蛋白質的加入可以抑制PMS的長期老化，其動力學模型（Avrami方程）表示蛋白質可以延緩支鏈淀粉重結晶的速率，并且體系的成核方式均偏向于散發(fā)性的棒狀生長（1＜n≤2），符合XRD的結果。3 種蛋白質對PMS的老化性質影響程度不一致，可能是因為3 種蛋白質的結構和分子質量不同，這表明蛋白質可以抑制PMS的老化，其中WPI對PMS的影響最為明顯。