洪 穎，王 利，陳 謹(jǐn)，王 蓉，羅 穎，楊 晨，陳道利，柳 燕

非傷寒沙門菌是指除傷寒和副傷寒以外的各種沙門菌，是一種常見的人獸共患傳染性疾病的病原菌，也是感染性腹瀉的重要病原菌。一項(xiàng)非傷寒沙門菌疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告顯示，全球每年有9 400萬(wàn)人因沙門菌患病，15.5萬(wàn)人死亡[1]。據(jù)歐洲食品安全管理局(Efsa)報(bào)道，2016年歐盟超過(guò)9.4萬(wàn)例感染是由非傷寒沙門菌引起的[2]。在我國(guó)由非傷寒沙門菌引起的食物中毒事件多年來(lái)居細(xì)菌性食物中毒首位[3]。非傷寒沙門菌血清型構(gòu)成和優(yōu)勢(shì)型別存在一定的地域特異性[4]，而不同血清型非傷寒沙門菌的耐藥性也存在顯著不同[5]，因此，非傷寒沙門菌的血清分型及耐藥性研究對(duì)臨床研究和疾病防控都有著十分重要的意義。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)非傷寒沙門菌的監(jiān)測(cè)也進(jìn)入了分子水平，PFGE技術(shù)是一種非常有效的追蹤感染源的分子分型方法，在流行病學(xué)調(diào)查、食源性疾病監(jiān)測(cè)和溯源等工作中均發(fā)揮著重要作用[6]。

基于馬鞍山區(qū)域腹瀉人群中非傷寒沙門菌的感染狀況、流行特征、血清型分布和分子分型等基線數(shù)據(jù)庫(kù)尚未建立，為了解本地區(qū)非傷寒沙門菌的流行狀況和病原學(xué)特征，現(xiàn)對(duì)2010－2018年來(lái)源腹瀉患者的非傷寒沙門菌進(jìn)行血清學(xué)分型PFGE分型和耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇馬鞍山市二院、四院、中心醫(yī)院和當(dāng)涂縣醫(yī)院4家定點(diǎn)醫(yī)院作為腹瀉監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)，收集2010－2018年以腹瀉癥狀為主訴、每日腹瀉≥3次、糞便性狀異常的感染性腹瀉病例標(biāo)本共2 998份，同時(shí)收集病例基本信息和流行病學(xué)史;標(biāo)本置于Carry-Blair培養(yǎng)基中冷藏運(yùn)送。

1.2 主要試劑與儀器 SBG增菌液(美國(guó)BD)，沙門顯色培養(yǎng)基(英國(guó)OXOID)，克氏雙糖瓊脂(KIA)培養(yǎng)基(英國(guó) OXOID)，SS培養(yǎng)基(英國(guó) OXOID)，XLD培養(yǎng)基(美國(guó)BD)，XbaⅠ酶(美國(guó) New England Biolabs)，蛋白酶 K(美國(guó) Amresco)，Sea Ke m Gol d瓊脂糖(美國(guó)Lonza)，Gel Red染料(美國(guó)Biotiu m)，診斷血清(丹麥SSI)，藥敏檢測(cè)板(上海星佰)，CHEF MAPPER型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)，Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad)，VITEK 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀(法國(guó) 梅里埃)，菌液比濁儀(美國(guó)Ther mo fisher)。

1.3 方 法

1.3.1 分離與鑒定 將糞便標(biāo)本保存液接種至SBG增菌液，36℃培養(yǎng)18 h，然后分別接種于沙門顯色培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基和XLD培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24 h。從中挑取數(shù)個(gè)可疑菌落接種于克氏雙糖瓊脂，36℃培養(yǎng)24 h?？梢删溆肰ITEK2全自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定。鑒定為沙門菌的菌株依據(jù)文獻(xiàn)[7]確定血清型別。

1.3.2 PFGE分型 按照Pulse Net China“沙門菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作程序”操作，以沙門標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812作為PFGE分子量標(biāo)準(zhǔn)，選用Xba I酶37℃酶切3 h，電泳19 h，電泳液溫度14℃。電泳結(jié)束后用Gel Red對(duì)膠塊進(jìn)行染色，去離子水洗脫。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，Bio Nu merics7.6軟件進(jìn)行聚類分析。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 按照革蘭陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板說(shuō)明書操作，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI-2018)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。試驗(yàn)使用的抗生素有氨芐西林(A MP)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢西丁(CFX)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、氨曲南(AZM)、亞胺培南(I MI)、美羅培南(MEM)、氨芐西林/舒巴坦(A MS)、阿莫西林/克拉維酸(A MC)、四環(huán)素(TET)、多西環(huán)素(DOX)、米諾環(huán)素(MIN)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(A MI)、卡那霉素(KAN)、鏈霉素(STR)、阿奇霉素(AZI)、萘啶酸(NAL)、左氧氟沙星(LEV)、環(huán)丙沙星(CIP)、復(fù)方新諾明(SXT)、磺胺異惡唑(Sul)、氯霉素(CHL)、多粘菌素E(CT)、多粘菌素B(PB)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/C)和頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/C)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)及生物信息學(xué)分析 采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Bio Nu merics7.6軟件對(duì)PFGE圖譜進(jìn)行分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 流行特征

2.1.1 時(shí)間分布 2010－2018年馬鞍山市腹瀉患者中非傷寒沙門菌的感染率為8.8%(263/2 998)，其中2017年最高(16.0%，42/263)，年間感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝72.98，P＜0.001)。2014－2018年，除1月份外各月份均有非傷寒沙門菌檢出，6－8月份感染率較高，見圖1。

2.1.2 人群分布 2014－2018年腹瀉患者中非傷寒沙門菌的感染率為11.4%(215/1891)，男性感染率為10.3%(106/1 028)，女性為12.6%(109/863)，不同性別檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.436，P＝0.509)。非傷寒沙門菌腹瀉病例最小年齡為1歲，最大為91歲，年齡中位數(shù)為26歲，以0～5歲年齡組感染率最高(15.9%，88/554)，年齡組間感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝20.813，P＝0.001)，見表1。

圖1 非傷寒沙門菌腹瀉病例的時(shí)間分布情況Fig.1 Time distribution of Non-typhoid Salmonella diarrhea cases

表1 2014－2018年不同特征腹瀉病例非傷寒沙門菌感染率的比較Tab.1 Comparison of Non-t yphoid Salmonella infection rates in different diarrhea cases from 2014 to 2018

2.2 血清型分布 263例非傷寒沙門菌病例中共分離出265株非傷寒沙門菌，共有36個(gè)血清型，主要為阿貢納沙門菌(25.4%)、腸炎沙門菌(20.4%)和鼠傷寒沙門菌(20.0%)。不同年份優(yōu)勢(shì)血清型有所不同，2014年以腸炎沙門菌為主，2015年以鼠傷寒沙門菌為主，而2016和2017年以阿貢納沙門菌為主，見圖2。

圖2 2010－2018年非傷寒沙門菌的血清型分布Fig.2 Serotype distribution of Non-typhoid Salmonella from 2010 to 2018

2.3 PFGE分型 為了解本地區(qū)是否發(fā)生過(guò)沙門菌腹瀉的既往暴發(fā)并建立和完善沙門菌的分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究對(duì)所分離的非傷寒沙門菌進(jìn)行了PFGE分型。下面列出了阿貢納沙門菌的PFGE聚類圖，62株阿貢納沙門菌分為25種帶型，帶型相似度在54.7%～100%，帶型相同的有8組，最多的組有19株，帶型結(jié)果顯示阿貢納沙門菌有成簇出現(xiàn)的情況，見圖3，其他非傷寒沙門菌未出現(xiàn)菌株成簇現(xiàn)象。

圖3 阿貢納沙門菌PFGE聚類圖譜Fig.3 PFGE clustering patter n of Salmonella Agona

2.4 耐藥性分析

2.4.1 耐藥率 為了解本地區(qū)近年來(lái)2種優(yōu)勢(shì)沙門菌的耐藥情況，本研究選取2015－2018年分離的39株腸炎沙門菌和30株鼠傷寒沙門菌，使用27種抗生素進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示測(cè)試菌株對(duì)A MP的耐藥率最高為79.7%，對(duì)STR和Sul的耐藥率較高分別為75.3%和66.6%，而對(duì)AZI和AMI全部敏感，見表2。

表2 69株非傷寒沙門菌對(duì)27種抗生素的耐藥率(%)Tab.2 Resistance rate of 69 strains of Non-typhoid Salmonella to 27 antibiotics(%)

2.4.2 耐藥譜 測(cè)試菌株的總耐藥率為95.6%(66/69)，多重耐藥率為82.6%(57/69)，耐7種及以上藥物的菌株占30.4%(21/69)。耐藥模式為A MP-TET-Sul-MIN-DOX-STR的菌株最多，占8.7%(6/69)。菌株最多可耐16種藥，見表3。發(fā)現(xiàn)2株產(chǎn)ESBLs的菌株，1株為腸炎沙門菌，1株為鼠傷寒沙門菌，2株菌均為多重耐藥菌株。

2.4.3 腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌對(duì)各種抗生素敏感性的比較 腸炎沙門菌對(duì)四環(huán)素類藥物(如TET、MIN和DOX)敏感性較鼠傷寒沙門菌高，而鼠傷寒沙門菌對(duì)喹諾酮類藥物(NAL、CIP和LEV)敏感性較腸炎沙門菌高。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門菌對(duì)A MC、GEN和CHL的敏感性較高，而鼠傷寒沙門菌對(duì)CFZ和Sul的敏感性較高。以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表4。

表3 非傷寒沙門菌的耐藥譜分布Tab.3 Dr ug resistance spectr um distribution of Non-typhoid Salmonella

表3 (續(xù))

3 討 論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)非傷寒沙門菌感染率有一定的地域性差異，本研究結(jié)果顯示2010－2018年馬鞍山地區(qū)腹瀉患者中非傷寒沙門菌的流行特征，非傷寒沙門菌腹瀉的平均感染率為8.8%，高于安徽合肥(2.9%)[8]，低于浙江余姚(12.9%)[9]。非傷寒沙門菌在0～5歲兒童組高發(fā)，這與我國(guó)多地區(qū)的研究結(jié)果一致[9-10]，可能與兒童免疫力低下有關(guān)。非傷寒沙門菌腹瀉具有一定的季節(jié)性，6－7月為高發(fā)時(shí)間，可能由于此段時(shí)間內(nèi)環(huán)境溫度有利于非傷寒沙門菌的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致沙門菌感染的幾率增加。因此，建議民眾應(yīng)在感染高發(fā)季節(jié)注意飲食，監(jiān)管部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管力度并做好防控措施。

感染性腹瀉是發(fā)展中國(guó)家的常見疾病，非傷寒沙門菌是感染性腹瀉的重要致病菌，其中腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌一直是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的2種優(yōu)勢(shì)血清型[11]。而本地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型為阿貢納沙門菌，這與國(guó)內(nèi)多地區(qū)[8-10，12]的結(jié)果均不一致，阿貢納沙門菌為優(yōu)勢(shì)血清型是本地區(qū)的流行特點(diǎn)。

當(dāng)今食品流通方式的多樣化使食源性疾病的發(fā)病模式亦發(fā)生改變，由暴發(fā)轉(zhuǎn)為多點(diǎn)散發(fā)。傳統(tǒng)的分型方法已經(jīng)不能滿足食源性疾病在暴發(fā)中溯源的需求[13]，PFGE目前被廣泛地應(yīng)用于疾病的溯源。建立并完善沙門菌的分子分型(PFGE)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)了解PFGE分型特點(diǎn)、流行病學(xué)分布、沙門菌的監(jiān)測(cè)及暴發(fā)調(diào)查尤為重要[14]。阿貢納沙門菌的PFGE聚類分析顯示有菌株成簇現(xiàn)象，提示本地區(qū)可能出現(xiàn)過(guò)阿貢納沙門菌腹瀉的既往暴發(fā)或聚集性疫情。

由于抗生素和廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，使得病原菌類型變化及耐藥性增強(qiáng)成為感染領(lǐng)域中的首要問(wèn)題[15]。有研究表明[16]2016年我國(guó)食源性沙門菌整體耐藥水平較高，多重耐藥嚴(yán)重，對(duì) NAL、TET、A MP的耐受性較強(qiáng)，且耐藥情況與2015年保持一致[17]。本研究結(jié)果顯示，測(cè)試菌株對(duì)A MP、STR和Sul的耐藥率較高，總耐藥率和多重耐藥率均高于北京昌平地區(qū)[18]。氟喹諾酮類和三代頭孢類抗生素是臨床上治療沙門菌感染的一線用藥[19-21]，而本研究中的測(cè)試菌株對(duì)三代頭孢的敏感性大于90%，對(duì)喹諾酮類敏感性低于50%，提示臨床需合理用藥，避免抗生素濫用造成的耐藥菌株的產(chǎn)生。研究還發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌對(duì)四環(huán)素類藥物的敏感性較高，而鼠傷寒沙門菌對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性較高，這種差異是否與不同沙門菌的基因組結(jié)構(gòu)有一定的相關(guān)性，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

本研究的腹瀉病例為監(jiān)測(cè)人群非傷寒沙門菌感染數(shù)據(jù)，隨著病例監(jiān)測(cè)力度的加強(qiáng)和范圍加大，以及醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力提高，建立全覆蓋本地區(qū)且監(jiān)測(cè)多種類病原的局域網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室將是疾病監(jiān)測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)，這樣會(huì)更有利于及早發(fā)現(xiàn)和控制腸道傳染性疾病。

表4 兩種優(yōu)勢(shì)血清型沙門菌對(duì)藥物敏感性的比較Tab.4 Comparison of drug sensitivity between two dominant serotypes of Salmonella