李春艷 鄭 嬌 燕 鳳 程 璐 宋婷婷 陳必良 徐慧 張建芳

空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安,710032)

傳統(tǒng)染色體核型分析是染色體疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1],但培養(yǎng)周期長(zhǎng)、易培養(yǎng)失敗,對(duì)5Mb以下的染色體缺失/重復(fù)無(wú)法正確檢出。BACs-on-Beads(BoBs)技術(shù)是一種快速產(chǎn)前診斷技術(shù),將DNA探針固定在經(jīng)過(guò)熒光編碼的Luminex微球表面,采用微球陣列分析同時(shí)檢測(cè)5種染色體非整倍體(13、18、21、X和Y)及常見(jiàn)的微缺失綜合征(Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、Williams-Beuren綜合征、Langer-Giedion綜合征、Prader-Willi/Angelman綜合征、Miller-Dieker綜合征、Smith-Magenis綜合征及DiGeorge綜合征),大大縮短了檢測(cè)時(shí)間,提高了產(chǎn)前診斷效率。本文對(duì)4639份羊水進(jìn)行BoBs快速檢測(cè),探討其在檢測(cè)微缺失/微重復(fù)綜合征中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2015年1月－2018年3月來(lái)本院產(chǎn)前診斷中心接受遺傳咨詢(xún)并進(jìn)行羊水穿刺的孕婦4639例,年齡(28.3±4.0)歲,孕周(20.3±2.5)周。孕婦的產(chǎn)前診斷指征包括：高齡(≥35歲)；血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)；超聲異常；無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)高風(fēng)險(xiǎn)；不良孕產(chǎn)史；其他(家族遺傳病史、夫妻一方染色體異常、不良接觸史等)。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1羊膜腔穿刺 超聲定位及引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺,抽取羊水30ml,15ml用于核型分析,10ml用于BoBs檢測(cè),5ml用于熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)。

1.2.2染色體核型分析 15ml羊水無(wú)菌操作下進(jìn)行培養(yǎng),常規(guī)染色體制片、G顯帶,每例樣本分析30個(gè)分裂相,采集3～5個(gè)核型圖。發(fā)現(xiàn)染色體異常或多態(tài)性時(shí),適當(dāng)增加分析的核型數(shù)。

1.2.3 BoBs檢測(cè) 采用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取樣本DNA。Prenatal BoBs TM試劑盒(PerkinElmer公司)進(jìn)行樣本檢測(cè),Luminex 200TM讀取信號(hào)強(qiáng)度,BoBsoft 2.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4熒光原位雜交技術(shù)(FISH) 羊水行細(xì)胞處理、玻片處理、雜交、洗片、復(fù)染后于熒光顯微鏡下觀察。每例樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)染色體異常時(shí),擴(kuò)大計(jì)數(shù)至100個(gè)細(xì)胞。

1.2.5染色體芯片分析(CMA) 采用CytoScan 750K Array(Affymetrix公司)檢測(cè)基因組DNA拷貝數(shù)變化(CNV)、單親二倍體及雜合性缺失,Ch AS軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

4639份羊水中BoBs共檢出微缺失/微重復(fù)20例(0.43%)。見(jiàn)表1。22q11.2缺失和重復(fù)綜合征進(jìn)行FISH驗(yàn)證,其余綜合征進(jìn)行染色體核型分析和CMA驗(yàn)證,結(jié)果均與BoBs一致。

表1 20例微缺失/微重復(fù)綜合征的檢測(cè)結(jié)果

染色體核型分析只檢出缺失/重復(fù)3例,且其缺失/重復(fù)的區(qū)域均大于15Mb,如病例8,核型結(jié)果為46,XX,del(4)(p15.3),BoBs結(jié)果顯示4p16.3缺失,為Wolf-Hirschhorn綜合征,CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)4p 16.3 p15.32(68,345_15,712,119)區(qū)域缺失15.6Mb。病例13,核型結(jié)果為46,XX,del(5)t(4；5)(q28.3；p14.1),BoBs結(jié)果發(fā)現(xiàn)5p15.3-p15.2缺失,為Cri du Chat綜合征,CMA驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)4q28.3q35.2(131,452,554_190,957,473)區(qū)域重復(fù)59.5Mb,同時(shí)5p15.33p14.1(113,576_26,634,417)區(qū)域缺失26.5Mb,即貓叫綜合征,缺失區(qū)域包含50個(gè)OMIM基因。病例20,核型結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記染色體存在,不確定其來(lái)源,BoBs結(jié)果顯示18p11.32p11.21重復(fù),CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)18p11.32p11.21(136,226_15,143,714)區(qū)域重復(fù)15Mb,為18p四體綜合征,電話隨訪得知,孕婦被告知染色體核型分析、BoBs和CMA檢測(cè)結(jié)果均異常并進(jìn)行遺傳咨詢(xún)后,均選擇終止妊娠。

病例19,孕婦因血清學(xué)篩查21三體高風(fēng)險(xiǎn)行羊水穿刺,BoBs檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Xp22.31缺失,CMA驗(yàn)證得 到Xp22.31(6,455,151_8,141,076)x1：1.69Mb,該缺失區(qū)域包括HDHD1、STS、VCX、PNPLA4、VCX2等OMIM基因,STS為遺傳性魚(yú)鱗病相關(guān)基因,患者可能有發(fā)育遲緩、魚(yú)鱗病、認(rèn)知能力差等臨床表現(xiàn),但該缺失區(qū)域具有不完全外顯率,臨床表現(xiàn)不完全一致,隨后對(duì)孕婦進(jìn)行CMA檢測(cè),結(jié)果完全一致,其決定繼續(xù)妊娠。病例6,7,17,孕婦得知檢測(cè)結(jié)果并進(jìn)行遺傳咨詢(xún)后,均決定繼續(xù)妊娠。

相較于染色體核型分析,BoBs技術(shù)的檢出率增加了0.37%(17/4639),如22q11.2微重復(fù)綜合征(病例1,3,12),Smith-Magenis綜合征(病例2),Di-George綜合征(病例4,5),Potocki-Lupski綜合征(病例10),Williams-Beuren綜合征(病例11,15,16)等。

3 討論

目前,染色體核型分析是染色體疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但培養(yǎng)周期長(zhǎng)、對(duì)技術(shù)人員要求高、易培養(yǎng)失敗,導(dǎo)致無(wú)法正常時(shí)間發(fā)放報(bào)告,增加了孕婦的緊張和焦慮情緒。隨著分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展,BoBs、FISH、CMA,多重連接依賴(lài)探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA),熒光定量PCR(QF-PCR)等不斷應(yīng)用于臨床,提高了產(chǎn)前診斷的效率及準(zhǔn)確性[2-3]。

本研究利用BoBs技術(shù)聯(lián)合染色體核型分析對(duì)4639份羊水進(jìn)行快速檢測(cè),檢出微缺失綜合征13例,微重復(fù)綜合征7例,檢出率為0.43%。產(chǎn)前BoBs結(jié)果與FISH、CMA等檢測(cè)結(jié)果一致,體現(xiàn)了該技術(shù)的準(zhǔn)確性及在臨床應(yīng)用的可靠性。染色體核型分析只檢出3例微缺失/微重復(fù)(缺失/重復(fù)區(qū)域均大于15Mb),聯(lián)合BoBs增加了0.37%的檢出率,避免了單純?nèi)旧w核型分析的假陰性結(jié)果。本研究中微缺失/微重復(fù)的檢出率較國(guó)內(nèi)外報(bào)道降低[4-5],可能與微缺失/微重復(fù)綜合征本身的發(fā)病率較低,且樣本量不夠大有關(guān)。

FISH技術(shù)主要用于檢測(cè)13、18、21、X和Y染色體非整倍體,對(duì)某些特定區(qū)域檢測(cè)需定制相應(yīng)的探針,耗時(shí)耗力,BoBs技術(shù)針對(duì)9種常見(jiàn)微缺失區(qū)域設(shè)置4～8個(gè)探針(9種微缺失綜合征總發(fā)生率約為1/1700[6]),提高了檢測(cè)的范圍及效率[7]。近年來(lái),CMA技術(shù)被推薦為胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)的首要手段,同時(shí)廣泛應(yīng)用于先天性心臟病、神經(jīng)發(fā)育異常、智力障礙等臨床評(píng)價(jià)[8-9],但CMA檢測(cè)價(jià)格昂貴,會(huì)產(chǎn)生很多意義不明確的結(jié)果(VOUS),增加了遺傳咨詢(xún)的難度。BoBs技術(shù)快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏、高通量,不需要進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)成功率高,結(jié)果明確,易于解讀,是核型分析的有力補(bǔ)充。

Choy等[10]對(duì)2153例樣本行染色體核型分析、QF-PCR及BoBs檢測(cè)結(jié)果顯示BoBs技術(shù)能準(zhǔn)確檢出所有的染色體非整倍體,同時(shí)對(duì)微缺失綜合征的檢出能力明顯優(yōu)于染色體核型分析及QF-PCR,敏感性為96.7%,特異性為100%。郭克建等[11]通過(guò)對(duì)921例羊水進(jìn)行快速診斷發(fā)現(xiàn),BoBs聯(lián)合核型分析的異常檢出率為6.84%,比單一體核型分析提高了16.7%,是一種可選擇的穩(wěn)定準(zhǔn)確的新技術(shù)。但是BoBs對(duì)點(diǎn)突變、平衡性重排、倍性變化、單親二倍體、甲基化改變及低比例嵌合(＜20%)等無(wú)法正確檢出[6],此外母血污染也會(huì)影響結(jié)果的判讀,因此遇到陽(yáng)性結(jié)果時(shí),需結(jié)合染色體核型分析、FISH、CMA等技術(shù)共同判斷[12-13]。臨床醫(yī)生應(yīng)在檢測(cè)前告知孕婦每種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)并根據(jù)產(chǎn)前診斷指征進(jìn)行恰當(dāng)?shù)牡倪z傳咨詢(xún)。

綜上所述,BoBs技術(shù)聯(lián)合核型分析的檢測(cè)模式在提高染色體異常檢出率的同時(shí)減少了患者的等待時(shí)間,適合大量產(chǎn)前診斷樣本的快速處理,值得在臨床中應(yīng)用。