陳學(xué)武 黃 芳 歐陽(yáng)健明

(暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，廣州 510632)

0 引 言

腎結(jié)石是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)疾病，且復(fù)發(fā)率高[1]。草酸鈣(CaOx)是腎結(jié)石中常見(jiàn)組分，約占70%[2]。一水草酸鈣(COM)、二水草酸鈣(COD)和三水草酸鈣(COT)是CaOx晶體的主要形式。在這3種晶型中，COM的熱力學(xué)穩(wěn)定性高，且COM晶體表面帶正電荷，與帶負(fù)電荷的受損傷腎上皮細(xì)胞黏附能力最強(qiáng)[3]，致病性也最強(qiáng)；相比之下，表面電荷近中性的COD晶體容易隨尿液排出體外[4]；而熱穩(wěn)性較差的COT則在腎結(jié)石中較少見(jiàn)。因此將COM轉(zhuǎn)化成COD有利于降低結(jié)石形成風(fēng)險(xiǎn)[5]。

研究表明，尿液中大量存在富含羧基(-COOH)和硫酸基(-OSO3H)的葡胺聚糖(GAGs)[6]。這些GAGs不僅可與游離的鈣離子結(jié)合生成可溶性配合物，降低尿液中CaOx的過(guò)飽和度，還能與CaOx晶體的生長(zhǎng)位點(diǎn)結(jié)合，抑制晶體的生長(zhǎng)[7]。植物多糖富含-COOH、-OSO3H等酸性基團(tuán)，具有與GAGs類似的性質(zhì)，且細(xì)胞毒性小[8-10]，因此，植物多糖有可能用于預(yù)防CaOx結(jié)石的形成。

植物多糖的生物活性與其分子量大小密切相關(guān)[11-12]。Zhao等[13]研究了低分子量的聚古羅糖醛酸硫酸酯(LPGS)對(duì)小鼠體內(nèi)的CaOx晶體生長(zhǎng)的調(diào)控作用，表明富含羧基的聚陰離子LPGS可以減少小鼠體內(nèi)晶體的沉積，對(duì)小鼠體內(nèi)的結(jié)石有更好的抑制作用。Rajeswari等[14]研究表明，與原始的肝素相比，低分子量肝素具有更高的生物利用自由度，對(duì)CaOx晶體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有抑制作用，可以預(yù)防結(jié)石形成。除此之外，我們前期的研究還表明多糖的生物活性及CaOx晶體的生長(zhǎng)調(diào)控還與多糖的濃度有關(guān)[15-16]。

黃芪是一種多年生草本植物，廣泛存在于溫帶地區(qū)。黃芪多糖(ASP)被視為發(fā)揮藥理活性的主要成分[17-18]。ASP及從黃芪中提取的皂甙和黃酮均對(duì)體外沖擊波碎石術(shù)引起的腎損傷具有保護(hù)作用[19]。ASP對(duì)患有腎小球腎炎的大鼠也具有明顯的腎臟保護(hù)作用[20]。而ASP和大黃酸結(jié)合，可以抑制腎小管細(xì)胞凋亡，提高腎臟功能，并對(duì)灌胃腺嘌呤引起的小鼠慢性腎功能衰竭具有保護(hù)作用[21]?；谏鲜鰣?bào)道，我們預(yù)測(cè)ASP有可能對(duì)腎結(jié)石的形成有抑制作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

草酸鈉(Na2Ox)和氯化鈣(CaCl2)均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)。

原始黃芪多糖(ASP0)由陜西慈緣生物有限公司生產(chǎn)，分子量為11.0 kDa。參照文獻(xiàn)[17]通過(guò)控制雙氧水的濃度和溫度得到3種分子量分別為8.4、4.7和2.6 kDa的降解多糖ASP1、ASP2和ASP3(表1)；并采用1H NMR譜、13C NMR譜、紅外光譜和氣質(zhì)聯(lián)用色譜等方法表征了這些多糖的結(jié)構(gòu)，表明降解前后ASP的單糖組成和糖殘基連接類型沒(méi)有明顯改變，ASPs都是以(1→4)-D-葡聚糖為主鏈，(1→6)-D-葡聚糖連接為支鏈的多糖結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)[20,22-23]報(bào)道的一致。

所用儀器有：D/max2400X射線粉末衍射儀(日本理學(xué))，OPTIMA-2000DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)(美國(guó)PE公司)，XL30型的掃描電子顯微鏡(荷蘭Philips公司)，傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司)，酶標(biāo)儀(SafireZ，Tecan，瑞士)，倒置熒光顯微鏡(IX51)(日本奧林巴斯公司)。

表1 0.5 g·L-1不同分子量ASPs誘導(dǎo)的CaOx晶體中COD的含量Table 1 COD content in CaOx crystals induced by 0.5 g·L-1ASPs with different molecular weights

1.2 CaOx晶體的合成及其表征

向各燒杯中加入 40 mL 22 mmol·L-1CaCl2溶液，然后加入一定量不同分子量ASP，并加蒸餾水補(bǔ)充至48 mL，磁力攪拌5 min后，加入40 mL 22 mmol·L-1Na2Ox，使體系終體積為88 mL，此時(shí)溶液中Ca2+和Ox2-的濃度為10 mmol·L-1。體系在37 ℃反應(yīng)10 min后，在恒溫條件下靜置2 h，離心分離。通過(guò)ICP測(cè)定上清液中可溶性鈣離子濃度，底層CaOx沉淀在真空干燥器中干燥，稱重后進(jìn)行XRD、FT-IR和SEM檢測(cè)。

X射線衍射(XRD)檢測(cè)：取上述CaOx沉淀于X射線衍射儀中分析，測(cè)試條件為CuKα射線，石墨單色器，工作電壓為30 kV，工作電流為25 mA，掃描范圍5°～60°，掃描速度8°·min-1，步寬0.02°·s-1，進(jìn)行定性和定量分析。

在合成的上述CaOx晶體中，二水草酸鈣(COD)的相對(duì)百分含量根據(jù)XRD圖采用K值法計(jì)算：

上式中ICOD和ICOM分別為COD的主衍射峰(200)晶面(d=0.618 nm)和一水草酸鈣(COM)的主衍射峰(101)晶面(d=0.593 nm)的強(qiáng)度。

FT-IR檢測(cè)：取2 mg已干燥的CaOx樣品，與200 mg KBr充分混勻，用瑪瑙研缽進(jìn)行研磨，研磨至看不見(jiàn)金屬光澤的粉末，壓片，采用紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描。

SEM觀察：稱取1 mg上述CaOx，分散在10 mL無(wú)水乙醇中，在低功率下超聲3 min后，點(diǎn)樣在10 mm×10 mm的玻片上，于50℃下烘干，樣品噴金后用掃描電鏡觀察晶體的尺寸與形貌，操作條件：電壓為5.00 kV，工作距離為5～10 mm，放大倍數(shù)為104。

1.3 CaOx晶體的ζ電位測(cè)量

參照文獻(xiàn)[24]的方法，稱取上述在不同條件下得到的CaOx沉淀10 mg，分散在30 mL二次蒸餾水中，懸浮液超聲10 min后用ζ電位分析儀測(cè)量其ζ電位。

1.4 多糖對(duì)HK-2細(xì)胞毒性檢測(cè)

HK-2細(xì)胞用含10%(V/V)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%(V/V)CO2和飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代采用胰蛋白酶消化法。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%匯合后用PBS緩沖液洗滌2次，加入0.25%(w/w)的胰酶-EDTA消化液，置37℃培養(yǎng)箱約3～5 min，在顯微鏡下觀察消化程度，消化適度后，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，充分吹打分散細(xì)胞，形成單細(xì)胞懸液。

將細(xì)胞懸浮液(密度為1×105mL-1)接種于96孔板中，每孔0.1 mL，在37 ℃、5%(V/V)的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細(xì)胞匯合成單層，改用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液孵育12 h，棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為20、60和100 μg·mL-1不同分子量的ASP，每孔0.1 mL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(多糖濃度為0)，培養(yǎng)24 h后采用CCK-8法，按照試劑盒測(cè)定方法進(jìn)行操作，置酶標(biāo)儀，測(cè)試450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率，得出多糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性作用。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

1.5 熒光顯微鏡觀察ASPs修復(fù)前后HK-2細(xì)胞中活性氧(ROS)水平

將細(xì)胞分為3組：(1)對(duì)照組——加無(wú)血清培養(yǎng)基；(2)損傷組——加入2.8 mmol·L-1草酸損傷3 h；(3)修復(fù)組——加入2.8 mmol·L-1草酸損傷3 h后再加入 100 μg·mL-1不同分子量 ASPs修復(fù)10 h。到達(dá)作用時(shí)間后，吸除上清液，樣品經(jīng)2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)在37℃染色30 min后，用PBS清洗3次去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 ASPs濃度調(diào)控CaOx晶體生長(zhǎng)的XRD分析

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)[15-16]，我們選擇在0.05～1.0 g·L-1范圍內(nèi)研究了4種ASPs對(duì)CaOx晶體生長(zhǎng)的影響。在不同濃度ASPs存在下形成的CaOx晶體的XRD如圖1所示。

晶面間距d=0.593、0.364、0.296和0.235 nm處的衍射峰分別歸屬于COM的和(130)晶面[25]，d=0.617、0.441、0.277和0.224 nm 處的衍射峰分別歸屬于COD的(200)、(211)、(411)和(213)晶面[26]。圖1顯示，在ASPs存在下可以誘導(dǎo)COD晶體形成，而且對(duì)于同一多糖，在0.05～1.0 g·L-1的范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，其誘導(dǎo)生成的COD含量逐漸增加(圖2)。研究表明過(guò)量的Ca2+離子有利于誘導(dǎo)COD晶體的形成，而過(guò)量的Ox2-離子則有利于促進(jìn)COM晶體形成[27]。ASPs分子中的-COOH可以與Ca2+離子配位，多糖分子周圍的Ca2+離子濃度快速增加，在局域部分增大了Ca2+與Ox2-的濃度比值；此外，由于多糖表面富集了帶正電荷的Ca2+離子，形成一個(gè)高能界面，同時(shí)被吸附的Ca2+離子自由度降低，能態(tài)增加，這種高能界面及高能量環(huán)境，均會(huì)促進(jìn)COD的形成[28-29]。因此，在ASPs存在下容易形成COD晶體，而且多糖濃度越高形成的COD越多。

COD晶體與腎細(xì)胞膜表面的黏附力遠(yuǎn)低于COM[30]，相對(duì)容易隨尿液排出體外，所以，采用ASPs誘導(dǎo)COD晶體形成有利于降低腎結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。

圖1 不同濃度ASPs存在下CaOx晶體的XRD圖Fig.1 XRD patterns of CaOx crystals induced by different concentrations of ASPs

圖2 不同分子量ASPs誘導(dǎo)的CaOx晶體中COD含量Fig.2 COD concent in CaOx crystals induced by different concentrations of ASPs with different molecular weights

2.2 不同濃度ASPs調(diào)控CaOx晶體生長(zhǎng)的FT-IR分析

在FI-IR圖中，COM的結(jié)晶水在3 058～3 488 cm-1會(huì)分裂成多個(gè)連續(xù)的小吸收峰，在1 618 cm-1處為羰基不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，在1 316 cm-1處為對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[31]，而COD的結(jié)晶水峰是一個(gè)大而寬的單峰，出現(xiàn)在3 452 cm-1。

不同濃度ASP1和ASP3存在下生成的CaOx晶體的FT-IR譜如圖3所示。隨著ASPs的濃度從0.05 g·L-1增大到1.0 g·L-1，CaOx晶體中不對(duì)稱伸縮振動(dòng)νas(COO-)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)νs(COO-)吸收峰都發(fā)生不同程度的藍(lán)移，如在ASP3存在下νas(COO-)從1 616 cm-1增加到 1 642 cm-1(圖 4)，νs(COO-)從 1 320 cm-1增加到1 329 cm-1，表明此時(shí)生成的CaOx晶體中COM含量在不斷下降，而COD含量則逐漸增加，因?yàn)镃OM和COD的νas分別為1 617和1 647 cm-1，νs分別為1 318和1 328 cm-1?？梢?jiàn)，F(xiàn)T-IR與XRD的結(jié)果基本一致。

在相同濃度范圍內(nèi)，ASP3引起的νas(COO-)和νs(COO-)藍(lán)移程度(26和9 cm-1)較 ASP1(24和6 cm-1)的大，表明分子量小的多糖對(duì)CaOx晶體的生長(zhǎng)影響更大。

2.3 ASPs分子量差異調(diào)控CaOx晶體生長(zhǎng)的XRD和FT-IR分析

圖5A為4種0.5 g·L-1ASPs誘導(dǎo)生成的CaOx晶體的XRD圖。由圖可知，4種ASPs均同時(shí)誘導(dǎo)生成了COM與COD晶體，但COD的含量差異顯著(表1)。分子量越低的多糖，其分子鏈越短，分子體積越小，粘度越小，水溶性增大，暴露出能與Ca2+配合的有效活性基團(tuán)(-COOH)比例增加[32-33]，因此，小分子量多糖的螯合Ca2+能力更強(qiáng)，誘導(dǎo)生成的晶體中COD含量更高(表1)。相比之下，沒(méi)有ASPs存在的空白對(duì)照組，只生成COM晶體。

圖3 不同濃度ASPs存在下生成的CaOx晶體的FT-IR光譜Fig.3 FT-IR spectra of CaOx crystal after adding different concentrations of ASPs

圖4 ASP濃度對(duì)CaOx晶體FT-IR譜中主要吸收峰波數(shù)的影響Fig.4 Effect of ASP concentration on the main absorption peaks in FT-IR spectra of CaOx crystals

圖5 0.5 g·L-1不同分子量多糖調(diào)控形成的CaOx晶體的(A)XRD圖和(B)FT-IR譜圖Fig.5 (A)XRD patterns and(B)FT-IR spectra of CaOx crystals induced by different molecular weights of 0.5 g·L-1ASPs

FT-IR譜(圖5B)進(jìn)一步證明了上述結(jié)果?？瞻捉M和ASP0誘導(dǎo)的CaOx晶體的νas(COO-)和νs(COO-)分別在1 617和1 318 cm-1左右，表明此時(shí)生成的CaOx晶體主要是COM。而0.5 g·L-1ASP1、ASP2和ASP3誘導(dǎo)的CaOx晶體的νas(COO-)分別為1 624、1 637和1 642 cm-1，νs(COO-)分別為1 321、1 325和1 328 cm-1，表明晶體中COD的含量逐漸增加。值得注意的是，由于ASP0誘導(dǎo)的COD含量較低(3.5%)，在FT-IR譜中未能檢測(cè)出來(lái)。

2.4 ASP分子量差異調(diào)控CaOx晶體生長(zhǎng)的SEM圖

SEM圖進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。不含多糖的空白組生成的晶體均為COM晶體(圖6a)，晶體形貌不規(guī)則，并存在聚集現(xiàn)象。分子量為2.6 kDa的ASP3調(diào)控得到COM與COD混合晶體(圖6e)，其中草帽形的COD晶體居多，與XRD定量結(jié)果(75.1%(w/w))基本一致。ASP1和ASP2調(diào)控所得的晶體(圖6(c，d))也是COM與COD共存，但草帽形COD的含量明顯少于ASP3組，與XRD檢測(cè)結(jié)果(分別為26.8%和66.0%(w/w))接近。ASP0調(diào)控得到的晶體中只出現(xiàn)少許四方形COD晶體(圖6b)。

圖6 0.5 g·L-1多糖誘導(dǎo)形成的CaOx晶體的SEM圖Fig.6 SEM images of CaOx crystals formed in 0.5 g·L-1ASPs

2.5 ASP分子量差異對(duì)CaOx晶體ζ電位的影響

圖7 不同分子量ASPs對(duì)CaOx晶體表面ζ電位的影響Fig.7 ζ potential of CaOx crystals induced by different molecular weights of ASPs

ζ電位可作為粒子間排斥力強(qiáng)度的度量。晶體表面ζ電位絕對(duì)值越大，表明晶體表面的電荷密度越大，晶體之間的排斥力也越大，晶體在溶液中的分散性越好，越利于抑制CaOx晶體的聚集。

由圖7可知，同一多糖，隨著其濃度的增加，ζ電位絕對(duì)值也逐漸增大。如ASP1，隨著cASP從0.05 g·L-1增大到1.0 g·L-1，誘導(dǎo)生成的晶體的ζ電位絕對(duì)值從22.1 mV增大到45.3 mV。

而對(duì)于不同分子量的多糖，在同一濃度下，由于分子量越小的ASPs越有利于吸附在晶體表面，從而有效增加了晶體表面的負(fù)電荷，導(dǎo)致晶體的ζ電位越負(fù)。如在濃度為0.5 g·L-1時(shí)，ASPs誘導(dǎo)生成的晶體ζ電位絕對(duì)值大小順序?yàn)椋篈SP3(40.2 mV)＞ASP2(36.5 mV)＞ASP1(32.7 mV)＞ASP0(25.1 mV)。

2.6 不同分子量ASPs對(duì)可溶性Ca2+離子濃度和CaOx沉淀量的影響

采用ICP檢測(cè)在不同濃度ASP1和ASP3的存在下生成CaOx晶體后溶液上清液中可溶性Ca2+離子量(nCa2+)，并檢測(cè)了CaOx沉淀的量(nCaOx)，結(jié)果如圖8所示。

ASPs分子中富含-COOH(～16.7%)，可以與 Ca2+配位使體系中Ca2+離子濃度增加(圖8)，從而減少CaOx沉淀的質(zhì)量。此外，富含-COOH的ASPs可以與Ca2+離子形成穩(wěn)定的配合物鏈，這種聚合物鏈可以作為晶體表面上的“柵欄”，抑制晶體的進(jìn)一步生長(zhǎng)[24]。

隨著ASPs濃度的增加，上清液中可溶性Ca2+也增加，而誘導(dǎo)生成的CaOx相應(yīng)減少。如隨著ASP3的濃度從0.05增大到1.0 g·L-1，上清液中Ca2+離子的濃度從6.9 μmol·L-1增大到 25.2 μmol·L-1，誘導(dǎo)生成的沉淀量從0.868 9 mmol減少到0.864 1 mmol。

在濃度相同時(shí)，多糖的分子量越小，上清液中可溶性Ca2+離子濃度越大，生成的沉淀量越少。

以上結(jié)果表明，小分子量多糖與Ca2+配位的能力增強(qiáng)，從而減弱了Ca2+與Ox2-的結(jié)合能力，進(jìn)而抑制了CaOx的生長(zhǎng)，抑制了CaOx結(jié)石的形成。

圖8 不同分子量ASPs誘導(dǎo)下生成的CaOx的物質(zhì)的量(nCaOx)和溶液中可溶性Ca2+物質(zhì)的量(nCa2+)Fig.8 Molar amount of CaOx precipitate(nCaOx)and molar amount of soluble Ca2+in the supernatant(nCa2+)induced by different molecular weights of ASPs

2.7 不同分子量ASPs對(duì)HK-2的毒性

采用CCK-8法檢測(cè)了4種ASPs對(duì)正常人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)的毒性(圖9)。HK-2與不同濃度(20、60和100 μg·mL-1)ASPs作用24 h后，細(xì)胞活力均仍在100%以上，且隨濃度增加，細(xì)胞活力增大，這表明在 20～100 μg·mL-1濃度內(nèi) ASPs不僅對(duì)HK-2細(xì)胞不表達(dá)毒性，而且還有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。

圖9 不同分子量ASPs對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響Fig.9 Cell toxicity of different molecular weights of ASPs to HK-2 cells

2.8 不同分子量ASPs對(duì)損傷HK-2細(xì)胞的修復(fù)作用

腎上皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致尿微晶粘附增加繼而誘發(fā)腎結(jié)石的重要原因之一。而對(duì)受損傷的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)有可能抑制腎結(jié)石的形成[1,8,11]。細(xì)胞本身具備豐富的抗氧化防御系統(tǒng)抵抗活性氧(ROS)。但當(dāng)ROS超過(guò)細(xì)胞自身的防御能力時(shí)就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)的發(fā)生，使得細(xì)胞功能受損甚至死亡。這種氧化性的細(xì)胞損傷能夠促進(jìn)CaOx晶體在腎臟部位的沉積[34]。

圖10為采用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)的各組細(xì)胞產(chǎn)生的ROS變化。DCFH本身沒(méi)有熒光，但可以被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化成有綠色熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度就可以知道細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。由圖10可知，損傷細(xì)胞產(chǎn)生的ROS分布于整個(gè)細(xì)胞中，其熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組細(xì)胞。而各修復(fù)組的ROS出現(xiàn)了不同程度的減弱，且分子量處在中間的ASP2減弱最為明顯，即ASP2清除ROS的能力最強(qiáng)。

圖10 不同分子量ASPs修復(fù)前后HK-2細(xì)胞ROS水平的熒光觀察圖像Fig.10 Fluorescence images of ROS in intracellular for damaged HK-2 cells before and after repairing by ASPs with different molecular weights

2.9 ASP分子量的差異對(duì)抑制腎結(jié)石形成能力的分析

分子量是影響多糖生物活性的重要因素。一定大小的分子量是多糖具備生物活性的必要條件。對(duì)于不同種類的多糖產(chǎn)生最佳生物學(xué)活性的相對(duì)分子量可能不同。我們的研究結(jié)果表明，雖然分子量最小的ASP3抑制CaOx形成、聚集和誘導(dǎo)COD的能力最強(qiáng)，但在修復(fù)受損傷的HK-2細(xì)胞時(shí)卻是分子量適中的ASP2(4.7 kDa)最強(qiáng)，分子量過(guò)大(11.0和8.4 kDa)或過(guò)小(2.6 kDa)均導(dǎo)致其修復(fù)能力降低。

ASP2的細(xì)胞修復(fù)能力最強(qiáng)歸因于：當(dāng)分子量太大時(shí)，多糖分子結(jié)構(gòu)緊密，體積很大，水溶性低，遷移到細(xì)胞膜的可能性會(huì)減小[35]，且難以通過(guò)細(xì)胞膜障礙發(fā)揮其生物作用。而分子量太小的ASP3難以形成能產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其生物活性下降。只有適當(dāng)分子量的多糖，不但具有較大的自由度和較小的空間位阻，需要更少的能量就可以分散到細(xì)胞膜的缺口[36]，更易通過(guò)靜電作用被細(xì)胞膜吸收，從而使細(xì)胞得到最大修復(fù)。因此，將高分子量多糖降解到適當(dāng)分子量后，其生物活性明顯提高。

綜上所述，ASP2和ASP3在溶液中的晶體生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出不同的活性，這個(gè)差異與研究體系的不同有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是活的體系，需要考慮的因素會(huì)更多。具體是ASP2還是ASP3的抑制腎結(jié)石能力增強(qiáng)，這需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

3 結(jié)論

4種分子量的ASPs均表現(xiàn)出抑制CaOx晶體生長(zhǎng)的能力。它們可以增加溶液中可溶性Ca2+離子濃度，減少CaOx沉淀的生成量；抑制COM生長(zhǎng)，誘導(dǎo)COD生成；增加晶體表面的ζ電位絕對(duì)值，降低晶體的聚集程度。ASPs調(diào)控CaOx晶體生長(zhǎng)具有明顯的濃度效應(yīng)；在小于1.0 g·L-1時(shí)，多糖濃度越高，活性越大。4種ASPs對(duì)HK-2細(xì)胞不僅沒(méi)有毒性，還可以修復(fù)被草酸氧化損傷的HK-2細(xì)胞，降低細(xì)胞的ROS水平。ASPs抑制CaOx生長(zhǎng)和誘導(dǎo)COD的能力與其分子量呈負(fù)相關(guān)，即分子量最小的ASP3抑制能力最強(qiáng)；而在修復(fù)受損傷的HK-2細(xì)胞時(shí)，分子量適中的ASP2修復(fù)能力最強(qiáng)。綜上所述，這些ASPs有可能成為防治CaOx結(jié)石的潛在藥物，特別是ASP2、ASP3。